马玉红,翁桂华,张 涛,江 波

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

阴离子交换树脂固定化果糖基转移酶的研究

马玉红,翁桂华,张 涛,江 波＊

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

从 13种离子交换树脂和吸附树脂中,筛选出固定化效果较好的大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D380为载体,以戊二醛为交联剂,通过先吸附后交联的方法对果糖基转移酶的固定化进行分析,并对固定化条件进行了优化。结果表明,最佳固定化条件为：加酶量为 200U/g树脂,吸附 pH为 6.0,吸附时间为 6h,吸附温度为 30℃,交联剂戊二醛浓度为 0.01%,交联时间为 6h,交联温度为 4℃,固定化酶活回收率最高可达 87.6%以上。

果糖转移酶,固定化,树脂

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉AS0023 为江南大学食品科学与技术国家重点实验室保藏菌种;树脂 D202-Ⅱ309 213 313苏青集团;X-5 DA201-B H-103 D301-Ⅲ 南开大学化工厂;D151 D152 D380 天津波鸿建材;5%戊二醛水溶液 中国医药 (集团)上海化学试剂公司。

Centrifuge 5084R冷冻离心机,SCIENTZ-2D超声波细胞破碎仪,Waters 209高效液相色谱仪,SHA-2冷冻恒温水浴振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂的预处理 吸附树脂采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馏水浸泡胀润、去杂,然后用 4% HCl、4%NaOH交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性,置于 4℃冰箱保存备用。

1.2.2 游离果糖转移酶提取方法 黑曲霉 AS0023细胞的制备见参考文献[12]。称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中,加入适量的 0.05mol/L、pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液,在冰浴环境中用超声波细胞破碎仪处理一定时间后,于 4℃下冷冻离心 (10000×g) 20min,收集上清液在 4℃条件下进行超滤以提高单位酶活,压力 0.15MPa,截留相对分子质量 10000,粗酶提取液放入冰箱保藏备用。

1.2.3 果糖转移酶的固定化方法 用滤纸吸干湿树脂表面的水后称取 0.5g于三角瓶中,加入一定量的酶液,在所需的 pH下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后,加入一定量的戊二醛进行交联。交联完成后,弃去上清,用缓冲溶液冲洗戊二醛残留及未固定上的游离酶,所得固定化酶用缓冲液浸泡待用。

1.2.4 酶活测定方法 游离果糖基转移酶活测定：一定体积底物浓度为10%(w/v)0.05mol/L、pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液于直径 50mm、100mL的恒温夹套酶反应器中,50℃下恒温搅拌反应 1h,于沸水中煮沸 10min终止反应。

1.2.5 糖组分测定方法 采用 HPLC(高效液相色谱)法[12]。HPLC,Waters 209系列,配有 R401示差折光检测器和 M740数据处理器;色谱柱：Hewlett Packard公司 APS Hypersil 4.6×100mm填料密度5μm;流动相：乙睛/水 75/25,流速 1mL/min;温度28℃;进样量：10μL。

1.2.6 酶活力定义 每分钟产生 1μmol蔗果三糖(1-kestose)为一个酶活力单位。酶用量为 2U/g蔗糖。固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的测定方法。固定化酶活回收率：酶活回收率定义为固定化酶活与所添加的总酶活的比值。

2 结果与分析

2.1 树脂载体的选择

不同树脂对果糖基转移酶的固定化效果如表 1所示。

由表 1可知,不同树脂的固定化效果差别明显,其中D380和D296R固定化酶活力和酶活回收率均表现突出。另外,表中还有几种阳离子交换树脂未列出,实验发现阳离子树脂基本不能固定化果糖基转移酶,这可能是因为使用阳离子交换树脂时,为使酶蛋白带正电荷,就要使固定化 pH低于该酶等电点,而过低的 pH不利于酶活性的发挥从而使酶失活。D380为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,其功能基团为伯氨基,因其具有弱碱性阴离子交换树脂较高的离子交换容量和容易再生等特点,已较成功地固定了木聚糖酶、α-淀粉酶等,故选择 D380树脂作为本实验的固定化载体。

2.2 固定化条件的优化

2.2.1 加酶量对固定化效果的影响 固定其它条件,选择不同的加酶量进行实验,结果如图 1所示。

图1 加酶量对固定化效果的影响

由图 1可以看出,随着加酶量的增大,固定化酶活逐渐增大,但酶活回收率逐渐降低,而当加酶量大于 400U/g载体时,固定化酶活的增加也变缓慢,这是因为在离子交换树脂的活性基团未被酶交联饱和前,固定化酶活将随着加酶量的增加而增加;在活性基团被酶交联饱和后,固定化酶的活力不在随加酶量的增加而明显增加,甚至当加酶量达到一定程度时,会因为结合的酶分子过多而造成酶作用的空间位阻加大,使酶活性增加缓慢,甚至出现下降。因此,综合考虑固定化酶活和酶活回收率,最适加酶量选择 200U/g。

2.2.2 吸附 pH对固定化效果的影响 固定其它条件,改变酶液 pH进行实验,结果如图 2所示。

图2 吸附pH对固定化效果的影响

由图 2可以看出,在pH3～6时,随着pH的增大,固定化酶活和酶活回收率都明显增大,当 pH大于 6以后,固定化酶活和酶活回收率都开始下降,这可能是与本实验所用果糖基转移酶的 pH稳定性有关,过高、过低的极端 pH会对酶的稳定性产生不利影响,致使固定化酶活降低,因此,最适的吸附 pH为 6.0。

2.2.3 吸附时间对固定化效果的影响 固定其它条件,选择不同吸附时间进行实验,结果如图 3所示。

由图 3可以看出,随着吸附时间的延长,固定化酶活和酶活回收率均增大,但是在 6h后增加缓慢,这是因为随着时间的延长,阴离子树脂表面的可交换基团与酶蛋白的交换已逐渐达到平衡,而在平衡后再继续增加吸附时间,树脂上的可交换基团基本没有了,所以变换缓慢,从经济角度考虑,选择 6h,既可以达到较好的固定化效果又可以缩短固定化时间。

表1 不同树脂的固定化效果比较

图3 吸附时间对固定化效果的影响

2.2.4 吸附温度对固定化效果的影响 固定其它条件,选择不同吸附温度进行实验,结果如图 4所示。

图4 吸附温度对固定化效果的影响

由图 4可以看出,在较低温度范围内,随着温度的升高,固定化酶活和回收率都逐渐增加,当温度超过 30℃后,固定化酶活迅速下降,这可能是因为温度过高会使戊二醛对酶的变性作用增大,同时温度过高也不利于酶的稳定性,温度较高时,酶容易失活;另一方面,蛋白质的吸附是吸热过程,在温度较低时,酶也不容易吸附到树脂上。因此固定化温度以30℃左右为宜。

2.2.5 戊二醛量对固定化效果的影响 固定其它条件,选择不同戊二醛量进行实验,结果如图 5所示。

图5 戊二醛量对固定化效果的影响

由图 5可以看出,在较低戊二醛浓度时,固定酶活逐渐增大,当戊二醛浓度继续增大时,固定化酶活和酶活回收率都随戊二醛浓度的增加而降低。在交联过程中,戊二醛既是固定化反应的交联剂,同时又是酶反应的变性剂,当戊二醛加入量不够时,交联反应进行不彻底,酶固定化不牢固;而交联剂加入过多时,过度的分子内交联反应会影响酶活性中心与底物的结合,从而降低了酶活,所以戊二醛浓度以0.01%(v/v)为宜。

2.2.6 交联时间对固定化效果的影响 固定其它条件,选择不同交联时间进行实验,结果如图 6所示。

图6 交联时间对固定化效果的影响

由图 6可以看出,随着交联反应时间的延长,酶活力逐渐增加,在此阶段主要发生的是酶分子间交联反应,但超过 6h以后,酶活力增加缓慢,这是因为分子间交联反应达饱和后,开始发生酶分子内交联,增加了酶分子间的空间位阻,直接影响到酶活性中心对底物的定位作用,且内扩散阻力也增大,而且戊二醛可发生交联反应的醛基数目有限,再增加交联时间对固定化效果的提高也很有限,所以交联时间以6h为宜。

2.2.7 交联温度对固定化效果的影响 固定其它条件,选择不同交联温度进行实验,结果如图 7所示。

图7 交联温度对固定化效果的影响

由图 7可以看出,在 0～4℃时固定化酶活和回收率逐渐增大,随着温度的逐渐升高固定化酶活反而降低,这可能主要是由于戊二醛的交联性质与其所在的 pH环境有关,温度偏高或者偏低都会改变戊二醛的 pH环境,从而使其降低甚至丧失交联反应的功能,因此交联温度以 4℃为宜。

3 结论

筛选出大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D380为载体,通过先吸附后交联的方法对果糖基转移酶进行固定化,优化的固定化条件为：加酶量为200U/g树脂,在 30℃、pH6.0的条件下吸附反应 6h,加 0.01%(v/v)的交联剂戊二醛在 4℃交联 6h,获得的固定化酶酶活回收率可达 87.6%。

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Study on the immobilization of fructosyltransferase by anion-exchange resin

MA Yu-hong,W ENG Gui-hua,ZHANG Tao,JIANG Bo＊
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Fruc tosyltransfe rase was imm ob ilized on13kinds of ion-exchange and adsorp tion res ins,am ong them D380showed the exce llent result for imm ob iliza tion.Then the enzym e was imm ob ilized through c ross-linkage of g luta ra ldehyde.The op t im um cond itions for the imm ob iliza tion we re as follows：200U of enzym e p e r g we t res in,pH 6.0,30℃,and6h,resp ec tive ly.The c ross linking temp e ra ture and t im e we re4℃ and6h resp ec tive ly,and the concentra tion of the c ross linking agent(g luta ra ldehyde)was0.01%.The ac tivity yie ld of imm ob ilized enzym e was above87.6%.

fruc tosyltransfe rase; imm ob iliza tion;res in

TS201.1

A

1002-0306(2010)02-0174-04

低聚果糖 (Fructooligosaccharides,简称 FOS),又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式为：G-F-Fn, n=1～3(G为葡萄糖,F为果糖)。它是由蔗糖和 1～3个果糖基通过β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。它是利用微生物或植物中具有果糖基转移活性的酶作用于蔗糖而得的,反应过程可以用以下反应式表示[1]：

由于 FOS具有优异的生理学功能而普遍地被用作保健食品配料[2],其在自然界广泛存在于牛蒡、洋葱、大蒜、香蕉等许多天然植物中[3],但含量很低。商品化的 FOS首先被 Hidaka H[4]用酶法开发成功,他从研究黑曲霉的果糖基转移酶开始,然后成功地应用于 FOS的工业化生产[5]。目前国内工业化生产FOS的技术多为液体深层发酵法,但该法的缺点是产酶菌丝体只能利用一次,在 FOS生产过程中,由于菌丝体及其培养基成分的存在并参与反应,使整个工艺繁杂,成本高[6]。而酶的固定化技术为提高酶的使用效率、降低生产成本提供了可能性。因此,近年来果糖基转移酶的固定化也逐渐成为研究的热点,已报道的有以多孔硅石、DEAE-纤维素、多孔离子交换剂、壳聚糖凝胶、大孔阴离子交换树脂 201等为载体的固定化方法[7-11]。实验以大孔苯乙烯系阴离子交换树脂D380为载体,采用先吸附后交联的方法对黑曲霉果糖基转移酶进行固定化,并对其固定化条件进行了探讨,为固定化酶在低聚果糖的生产提供了理论依据。

2009-03-30 ＊通讯联系人

马玉红(1982-),女,硕士研究生,研究方向：食品生物技术。

重点实验室目标导向项目(SKLF-MB-200804)。