赵海锋,柴 华,赵谋明,＊,崔 春,王金水

(1.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640; 2.河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

挤压预处理后小麦面筋蛋白酶解特性的变化

赵海锋1,柴 华1,赵谋明1,＊,崔 春1,王金水2

(1.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640; 2.河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

小麦面筋蛋白经挤压预处理后,利用复合蛋白酶(Protamex)和木瓜蛋白酶(Papain)酶解。与未挤压的酶解产物相比较,经挤压预处理后的酶解产物水解度明显提高(77%～122%),鲜味明显增强,但蛋白质回收率有所下降。挤压预处理后的小麦面筋蛋白酶解产物高分子组分减少,低分子组分显著增加,面筋蛋白酶解液中的鲜味物质以小分子肽和游离氨基酸为主。

挤压预处理,小麦面筋蛋白,酶解特性,风味

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦面筋蛋白 河南莲花味精集团;复合蛋白酶(Protemax) 丹麦诺维信公司;木瓜蛋白酶(Papain) 广州裕立宝国际有限公司;标准肽样品GlobinⅢ(分子量 2512)、GlobinⅡ(分子量 6214)、GlobinⅠ(分子量 8519)、GlobinⅠ +Ⅲ(分子量10700)、GlobinⅠ+Ⅱ(分子量 14404)、Globin(分子量 16949),美国 Amersham公司;NaOH、HCl、甲醛 国产分析纯。

LC26A型高效液相色谱仪 日本岛津公司; KDN-2C型定氮仪 上海纤检仪器有限公司; HHW-21CU-600型电热恒温水槽 上海福马实验设备有限公司;SHA-B水浴恒温振荡器 金坛市宏华仪器有限公司;SPJ-40双螺杆挤压机 陕西得爱食品公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质含量的测定 采用微量凯氏定氮法,小麦面筋蛋白的换算系数为 5.7[8]。

1.2.2 氨基氮的测定 酶解液中氨基氮测定采用甲醛滴定法[9-10]。

1.2.3 水解度测定[11]计算公式如下：

水解度 (DH,%)= [(N2-N1)/(N0-N1)] ×100%

式中：DH-水解度,%;N0-总氮含量,%;N1-酶解前游离氨基酸含量,%;N2-酶解后游离氨基酸含量,%。

1.2.4 蛋白质回收率的测定[12]酶解液经 4000r/min离心分离 20min,取上清液按半微量凯氏定氮法测定水溶性蛋白质含量。

蛋白质回收率(PR,%)=(水溶性蛋白含量/原料蛋白含量)×100%

1.2.5 酶解液的分子量分布 采用 Amersham蛋白质分析纯化系统,分离柱为 Superdex-peptide 30/100 GL预装柱 (Vt=24.0mL,Vo=8.0mL),进样体积为40μL,检测波长为 214nm,最大压力为 1.8MPa,洗脱液为含 0.25mol/L NaCl的 pH7.2磷酸缓冲液,洗脱流速为 0.5mL/min。

标准肽样品与洗脱体积拟合直线方程为：

y=-0.0578x+4.6289(R2=0.9960)

其中：y-标准肽分子量的对数;x-是洗脱体积,mL。

1.2.6 氨基酸 (AA)组成分析 样品酸解后用高效液相色谱 (HPLC)分析,色氨酸则将样品碱解后用HPLC分析。

氨基酸检测条件：美国Waters高效液相色谱, PI CO.T AG氨基酸分析柱,温度为 38℃,流速为1mL/min,检测波长为 254nm。

1.2.7 感官评定[13]取小麦面筋蛋白酶解液的上清液加入 0.5%NaCl,混合均匀后,置于 60℃水浴中加热,然后进行感官评定。以表 1为标准对各个酶解液进行鲜味评分。

表1 鲜味强度分析的标准溶液

1.3 工艺方法[14]

1.3.1 小麦面筋蛋白挤压膨化处理 采用干法挤压,在前期研究的基础上设定挤压机机筒温度为150℃,螺杆转速为 135r/min,模孔孔径 5mm,物料湿度 20%,以 4±0.5kg/min的喂入量通过挤压机,当挤压机运转稳定并达到设定的温度后开始收集样品,样品放入烘箱中烘干到含水率为 5%,碾磨过 40目筛。

1.3.2 酶解条件及工艺 用于小麦面筋蛋白酶解的酶种类、酶解条件及工艺如下：

Protamex酶解条件：pH6.8,温度 50℃,酶浓度3500U/g,蛋白浓度 8%,酶解时间 3.0h;Papain酶解条件：pH6.5,温度 50℃,酶浓度 4000U/g,蛋白浓度6%,酶解时间 4.5h。

小麦面筋蛋白→加水搅拌→悬浮液→调节 pH→水浴中加热搅拌→达到最适作用温度后加入蛋白酶→搅拌酶解→沸水浴中加热灭酶 (100℃,15min)→冷却→10000r/min离心15min→测上清液的酶解指标

2 结果与讨论

2.1 挤压预处理后小麦面筋蛋白酶解产物水解度的变化

分别采用 Protamex和 Papain蛋白酶水解挤压预处理前后的小麦面筋蛋白,测定其酶解产物水解度,以考察挤压预处理前后水解度的变化,结果见图 1。

图 1 挤压预处理前后小麦面筋蛋白酶解产物的水解度

由图 1可以看出,挤压预处理可以显著提高小麦面筋蛋白酶解产物的水解度。挤压预处理前后, Protamex和 Papain酶解产物的水解度分别从 6.93%提到 15.39%和从 6.17%提高至 10.94%,分别提高了122%和 77%。这可能是因为挤压预处理使得小麦面筋蛋白变性,结构变得更为疏松,有利于酶的作用,从而提高了酶解产物的水解度[15]。

2.2 挤压预处理后小麦面筋蛋白酶解产物蛋白质回收率的变化

分别采用 Protamex和 Papain蛋白酶水解挤压预处理前后的小麦面筋蛋白,测定其酶解产物的蛋白质回收率,以考察挤压预处理前后蛋白质回收率的变化,结果见图 2。

表 2 挤压预处理前后小麦面筋蛋白酶解产物中肽分子量分布

图2 挤压预处理前后小麦面筋蛋白酶解产物的蛋白质回收率

由图 2可知,挤压预处理降低了小麦面筋蛋白酶解产物的蛋白质回收率。挤压预处理前后, Protamex和 Papain酶解产物的蛋白质回收率分别降低了7.5%和12.2%。这可能是由于小麦面筋蛋白分子及分子间内二硫键的形成、酶解产物相互作用、重新聚集的缘故[16]。综合水解度和蛋白质回收率的结果,Protamex酶解的效果优于 Papain酶解效果。

2.3 挤压预处理前后小麦面筋蛋白酶解产物肽分子量分布的变化

挤压预处理前后小麦面筋蛋白 Protamex和Papain酶解产物肽分子量变化见图 3。

图 3 挤压处理前后小麦面筋蛋白 Protamex(A)和 Papain(B)酶解产物的肽分子量分布

由图 3可以看出：预处理前后的面筋蛋白酶解液的肽分子量分布图谱变化显著,挤压后两种酶解产物中大分子量肽占总肽量比值明显减少,而小分子量肽占总肽量比值增加,这表明挤压预处理后小麦面筋蛋白的结构更适合蛋白酶的酶解。此外, Protamex酶解产物肽分子量分布的较均匀,而 Papain酶解产物肽分子量相对来说更趋向于集中在某一分子段内,从而说明 Protamex酶能对分子内部较多的位点起作用,肽的分子量更小。

由表2中不同酶解产物中各肽段占总肽量的比例可以看出,挤压预处理后,Protamex和 Papain酶解产物中分子量大于 5000Da肽段含量显著降低,分别降低了75.2%和 80.8%,酶解产物中分子量介于 1000～5000Da间肽段则有所增加;分子量 120～1000Da肽段大幅度增加,分别增加了 101.7%和 116.9%。此外,挤压处理后,面筋蛋白 Protamex和 Papain酶解产物中分子量 ＜120Da的肽段也分别增加了 49.0%和 62.0%。这些结果说明大部分难以酶解的小麦面筋蛋白组分被降解,原因是挤压处理导致了小麦面筋蛋白结构发生变化和重排,而重排后的面筋蛋白结构更有利于酶解[15]。

2.4 挤压后小麦面筋蛋白酶解液氨基酸组成的变化

小麦面筋蛋白富含谷氨酸、脯氨酸和甘氨酸,这是小麦面筋蛋白结构不同于其它蛋白的原因之一[17]。蛋白质在酶解过程中被降解成多肽、寡肽和游离氨基酸,对呈味有很大贡献的是酶解产物中的寡肽和游离氨基酸。小麦面筋蛋白富含 Glu,因此酶解液中主要以鲜味为主。二肽也是酶解液中的风味物质,其风味特性与氨基酸的组成密切相关。提供鲜味的二肽中一般都含有 Glu或Asp,如鱼蛋白酶解物 Glu-Glu、Glu-Ser、Thr-Glu、Glu-Asp等和酸性肽Gly-Asp、Ala-Glu、Glu-Leu等都具有鲜味的特性[18]。

由图 3酶解产物肽分子量分布的结果可知, Protamex酶解液肽的分布更为丰富,于是选择挤压预处理小麦面筋蛋白 Protamex酶解产物进行氨基酸及游离氨基酸分析,结果见表 3。挤压预处理前后小麦面筋蛋白 Protamex酶解液中游离氨基酸含量偏低,分别为 329.85mg/100mL和841.12mg/100mL,仅占全部氨基酸的 5.0%和 14.3%,说明酶解过程中产生的酶解产物主要以肽为主,但挤压处理则可以显著提高游离氨基酸含量。酶解液中游离 Leu和 Phe含量最高,分别为 19.68%和 11.44%,挤压预处理使得这两种游离氨基酸的含量分别降为 14.56%和 9.47%。此外,小麦面筋蛋白的氨基酸中含量最高的 Glu和Pro,在酶解液的游离氨基酸比例中并不占优势。小麦面筋蛋白中鲜味氨基酸预处理前后分别为50.15%和 51.98%,而酶解液中游离的鲜味氨基酸仅有15.74%,虽说挤压后的酶解液中游离鲜味氨基酸的比例又下降到 10.85%,但是游离鲜味氨基酸的总量则提高了 40.4%。因此,酶解液中的鲜味氨基酸并未游离出来,有一部分以鲜味肽的形式存在。预处理后各个氨基酸游离部分与全部氨基酸的比例有所变化,说明挤压预处理后酶解位点发生了改变,有利于更好地进行控制性深度酶解。

2.5 挤压处理后小麦面筋蛋白酶解产物风味的变化

以表 1为标准,对挤压处理前后的酶解产物进行鲜味评分,结果见表 4。对两种不同的酶解产物而言,挤压预处理后可以使得酶解产物的鲜味更加突出。结合表2和表3的分析结果说明,酶解液中的鲜味物质是以小分子肽和游离氨基酸为主。经过挤压处理后,小麦面筋蛋白酶解产物鲜味氨基酸含量的增加,从而达到了其风味阈值,亦或是游离氨基酸之间、氨基酸和小分子肽之间的协同作用而使得挤压处理后酶解产物的鲜味更加突出。

表 3 挤压预处理前后小麦面筋蛋白酶解产物的氨基酸组成

注：鲜味氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸和丝氨酸之和;括号内数值为单个氨基酸含量占总氨基酸量的百分数。

表 4 挤压预处理前后小麦面筋蛋白酶解产物的鲜味评分值

3 结论

挤压预处理可以显著改变小麦面筋蛋白的酶解特性。挤压预处理后,小麦面筋蛋白酶解产物的水解度提高了 77%～122%,蛋白质回收率则下降了7.5%～12.2%;高分子量的肽组分比例显著减少,低分子量的肽组分比例则明显增加;氨基酸组成发生了明显的变化,游离氨基酸含量显著增加;酶解产物鲜味增强,酶解液中的鲜味成分主要以小分子肽和游离氨基酸为主。因此,挤压预处理是一种辅助提高小麦面筋蛋白酶解效率和酶解产物呈味强度行之有效的方法。

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Changes in enzymatic hydrolysis properties of wheat gluten treated with extrusion

ZHAO Ha i-feng1,CHA I Hua1,ZHAO M ou-m ing1,＊,CUIChun1,WANG Jin-shui2
(1.College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450052,China)

The Protam ex and Pap a in-induced hyd rolys is of whea t g luten w ith or w ithout extrus ion trea tm ent we re s tud ied in this p ap e r.Results showed tha t extrus ion trea tm ent resulted in s ignificant inc reases of77%～122% in deg ree of hyd rolys is and in um am i flavor and som ewha t dec rease in p rote in recove ry for whea t g luten enzym a tic hyd rolysa tes.Comp a red w ith na tive whea t g luten hyd rolysa tes,the re la tive p e rcentage of the p ep tides re leased from extruded whea t g luten w ith high and low m olecula r we ight dec reased and inc reased s ignificantly, resp ec tive ly.Results from am ino ac id ana lys is and m olecula r we ight d is tribution of p ep tides sugges ted tha t the flavor comp ounds in resulting hyd rolysa tes m a inly cons is ted of low m olecula r we ight p ep tides and free am ino ac ids.

extrus ion trea tm ent;whea t g luten;enzym a tic hyd rolys is p rop e rties;flavor

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0093-05

小麦面筋蛋白是小麦淀粉生产过程中的一种副产品,是大宗低值食物蛋白资源。小麦面筋蛋白因含有较多的疏水性氨基酸、分子体积及分子内疏水作用区域较大等原因,使得其在水中溶解性差,导致其功能特性无法与其它蛋白竞争,制约了其在食品和非食品领域的应用[1-2]。改性尤其是酶解改性是改善小麦面筋蛋白功能特性的核心技术,此外,由于小麦面筋蛋白分子中鲜甜味的氨基酸含量丰富,采用深度酶解技术制备鲜味特征明显的呈味基料,是小麦面筋蛋白深加工的一个重要途径。但小麦面筋蛋白在酶解过程中尚存在一些诸如水解度低、水解速度慢、水解时间长、水解效率低等问题,因此,寻求小麦面筋蛋白高效酶解技术是小麦面筋蛋白改性的关键。利用双螺杆挤压机对小麦面筋蛋白进行挤压处理,蛋白质在高温、高压和剪切的综合作用下,发生一系列复杂的物理化学反应,导致维持蛋白质三、四级结构的结合力变弱,使蛋白质分子呈线性定向排列[3],由球状聚集态重组为纤维状,发生变性,提高酶解敏感性[4]。以前研究多集中在挤压处理对蛋白质功能特性的影响[5-7],而挤压处理后小麦面筋蛋白酶解产物特性的变化尚未见报道,而阐明该机理对于提高小麦面筋蛋白酶解效率、改善其功能特性具有重要的理论和实践意义。因此,本文旨在研究挤压预处理后小麦面筋蛋白酶解产物特性的变化,考察挤压预处理是否可以提高小麦面筋蛋白的酶解效率和提高酶解产物的呈味能力,为小麦面筋蛋白深加工呈味基料提供理论和方法的指导。

2009-04-13 ＊通讯联系人

赵海锋(1977-),男,讲师,博士,研究方向：发酵工程、食品生物技术。

国家自然科学基金 (200676044);国家新技术研究发展(863)计划(2006AA10Z326)。