沈 飚，胡兴娟，徐君辉，贝文联，吴祖芳

(1.舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316000；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

水产品中添加剂多聚磷酸盐抑菌效果的研究

沈 飚1，胡兴娟1，徐君辉1，贝文联1，吴祖芳2

(1.舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316000；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

目的：分析多聚磷酸盐中主要抑菌成分，并找出临界抑菌浓度。方法：利用微生物法，用pH值分别为6.0、7.2、8.0的检测琼脂研究正磷酸盐、三聚磷酸盐、焦磷酸盐和三偏磷酸盐对枯草芽孢杆菌和滕黄微球菌的抑菌作用。结果：三聚磷酸盐和焦磷酸盐是影响抑菌效果的主要因素，其引起抑菌剂阳性的临界质量浓度分别为0.2g/100mL 和0.2g/100mL，用P2O5计分别为1157.56mg/kg和1601.43mg/kg。通过对三聚磷酸盐和焦磷酸盐进行两因素三水平正交试验结果分析，发现两者互存时，只要有一种质量浓度达到临界值就会产生抑菌阳性效果(抑菌圈宽度≥2mm)。结论：通过控制焦磷酸盐和三聚磷酸盐使用量，可降低由多聚磷酸盐引起的抑菌剂阳性风险。

多聚磷酸盐；三聚磷酸盐；焦磷酸盐；抑菌；微生物方法

Abstract：Objective:To find out which ones of four polyphosphates are antimicrobial molecules and to determine their critical antimicrobial concentrations. Methods:Liquid agars at different pH values (6.0, 7.2 and 8.0) were used to test the inhibitory effects of orthophosphate, tripolyphosphate, pyrophosphate and trimetaphosphate onBacillus subtilisandMicrococcus luteus.Results:Two of the four polyphosphates were an antimicrobial, including tripolyphosphate and pyrophosphate. Their critical concentrations causing antimicrobial positivity were 0.2 g/100mL and 0.3 g/100 mL (1157.56 mg/kg and 1601.43 mg/kg,calculated as P2O5), respectively. A two-factor, three-level orthogonal array design was employed to evaluate the synergistic antimicrobial effect of tripolyphosphate and pyrophosphate, and the results revealed that as long as one of the two polyphosphates simultaneously added had a concentration in their mixed solution equalling or exceeding its own critical concentration, a positive antimicrobial result (inhibition zone equalling or exceeding 2 mm) could be observed. Conclusion:The risk of antimicrobial positivity caused by polyphosphates can be reduced by controlling the amounts of added tripolyphosphate and pyrophosphate.

Key words：polyphosphate；tripolyphosphate；pyrophosphate；antimicrobial；microbiologic method

多聚磷酸盐类添加剂作为保水剂和品质改良剂在水产品加工中被广泛应用，具有保持水分、改善口感色泽、增重等作用[1-2]。多聚磷酸盐会促进血液凝结，其降解产物磷酸盐也会增大摄入者心脑血管疾病发生的可能性[3-4]，因此，欧盟等国对进口虾仁有限量要求(5g/kg)。另据研究表明多聚磷酸盐具有抑菌作用[5-6]，近几年我国出口虾仁多次被通报抑菌剂超标，主要是由添加抑菌剂多聚磷酸盐所致[7]。因此如何突破欧盟抑菌剂技术壁垒成为水产出口企业关注的新问题。

微生物法的样品前处理简单、操作简便、灵敏度高，在一定范围内有良好的剂量-抑菌关系，被广泛应用于抗生素的抑菌效果检测[8-10]。枯草芽孢杆菌既对抗革兰氏阳性菌药物敏感，又对抗革兰氏阴性菌药物敏感，同时还有芽孢的特性，能耐受高温、干燥和渗透压的影响，因此具有较好的稳定性、安全性，对环境及人畜无污染。滕黄微球菌对多种药物具有较好的敏感性[11]。此外，不同pH值培养基影响药物敏感性。因此，本实验以枯草芽孢杆菌和滕黄微球菌作为目标敏感菌，通过微生物法研究多聚磷酸盐主要成分正磷酸盐、三聚磷酸盐、三偏磷酸盐和焦磷酸盐在不同pH值培养基上的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、滕黄微球菌(ATCC9341) 中国药品生物制品检定所。

检测琼脂(pH6.0)、检测琼脂(pH7.2)、检测琼脂(pH8.0) 德国Merker公司；营养琼脂 北京陆桥公司；标准品：正磷酸盐、三聚磷酸盐、焦磷酸盐、三偏磷酸盐 Sigma公司。

1.2 仪器与设备

BK-6160培养箱、FISHER-LEGEND MACH1.6R高速冷冻离心机 Thermo公司；MSI涡旋混合仪 德国IKA公司；LDZX-50KBS高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；Logic A2生物安全柜 美国Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株处理和平板制备方法

枯草芽孢杆菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面培养物用适量灭菌生理盐水洗涤菌苔，制成悬液，用吸管将此悬液接种于盛有100mL普通营养琼脂培养基的克氏瓶中，在35～37℃条件下培养，镜检芽孢数达85%以上停止培养。用40mL灭菌生理盐水洗下菌苔，制成悬液，65℃水浴加热30min将菌体杀死，经3000r/min离心20min，弃去上清液，如此重复洗涤芽孢两次，然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液。置2～8℃冰箱中保存。

滕黄微球菌悬液制备：取滕黄微球菌的营养琼脂斜面培养物，用适量的灭菌生理盐水洗涤菌苔，制成悬液，用吸管移至盛有营养琼脂培养基克氏瓶中，26～27℃培养18～24h后，用灭菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液。置2～8℃冰箱中保存。

Bs6平板：将枯草芽孢杆菌孢子悬浮液接种至pH6检测琼脂液中，调节浓度为5×104个孢子/mL琼脂。取5mL被接种过的琼脂液倒在平板上，备用。

Bs7.2平板：将枯草芽孢杆菌孢子悬浮液接种至pH7.2检测琼脂液中，调节浓度为5×104个孢子/mL琼脂。取5mL被接种过的琼脂液倒在平板上，然后放在冷的平板上冷却，备用。

Bs8平板：将枯草芽孢杆菌孢子悬浮液接种至pH8检测琼脂液中，调节浓度为5×104个孢子/mL琼脂。取5mL被接种过的琼脂液倒在平板上，然后放在冷的平板上冷却，备用。

MI8平板：将滕黄微球菌孢子悬浮液接种至pH8检测琼脂液中，直至浓度为5×104个孢子/mL琼脂。5mL被接种过的琼脂液倒在平板上，然后放在冷的平板上冷却，备用。

1.3.2 抑菌剂检测方法

每一个样品准备Bs6、Bs7.2、Bs8和MI8四个平板，每一个平板上放置直径为6mm的两张纸片。吸取10μL试剂加在纸片上，在室温(25℃左右)放置10min，以便使供试样液能扩散至培养基。Bs6、Bs7.2、Bs8平板(30±1)℃培养(20±2)h以及MI8平板(36±1)℃培养(26±2)h后用游标卡尺测量出现的抑菌圈的宽度。同时在滕黄色微球菌平板上加红霉素标准纸片(0.0025μg/片)做阳性对照，在枯草芽孢杆菌上加卡那霉素标准纸片(0.05μg/片)做阳性对照，6mm标准空白纸片加10μL无菌水做阴性对照。如果抑菌圈的宽度大于2mm则认为抑菌剂阳性。如果结果可疑(同一样品的检测结果为一个阳性，另一个阴性)，实验必须重复，如果第二次实验仍然可疑，则判为阴性。

1.3.3 多聚磷酸盐各成分抑菌效果检测

将正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、10.0g/100mL不同质量浓度，根据抑菌剂检测方法分别进行抑菌效果检测，以空白作对照，测定抑菌圈宽度。

1.3.4 磷酸盐类质量浓度换算为以P2O5计的方法

三聚磷酸盐质量浓度以P2O5计的换算公式：M/367.86×141.94×3/2

焦磷酸盐质量浓度以P2O5计的换算公式：M/265.90×141.94×2/2

式中，M：如质量浓度0.2g/100mL，换算为2000mg/kg，M即为2000。

1.3.5 焦磷酸盐和三聚磷酸盐联合作用对抑菌效果的影响

对三聚磷酸盐和焦磷酸盐进行两因素三水平的正交试验设计，研究其对抑菌效果的影响。

2 结果与分析

2.1 多聚磷酸盐各成分抑菌效果检测

对水产品添加剂的单一成分，包括正磷酸盐、三聚磷酸盐、焦磷酸盐和三偏磷酸盐，进行抑菌效果检测，结果见表1～4。正磷酸盐、偏磷酸盐产生抑菌效果时的质量浓度太高，在实际加工中不用。因此，虾仁产生抑菌剂是多聚磷酸盐中三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果产生的。在三聚磷酸盐和焦磷酸盐的质量浓度分别为0.2、0.3g/100mL时，产生抑菌圈宽度为2.0mm。

表1 不同质量浓度正磷酸盐产生的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activity of orthophosphate at different concentrations mm

表2 不同质量浓度三聚磷酸盐产生的抑菌效果Table 2 Antimicrobial activity of tripolyphosphate at different concentrations mm

表3 不同质量浓度焦磷酸盐产生的抑菌效果Table 3 Antimicrobial activity of pyrophosphate at different concentrations mm

表4 不同质量浓度三偏磷酸盐产生的抑菌效果Table 4 Antimicrobial activity of trimetaphosphate at different concentrations mm

2.2 三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界测试

通过对三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果检测发现，质量浓度分别为0.2g/100mL和0.3g/100mL时，在Bs7.2平板上产生宽度为2mm的抑菌圈。因此选择Bs7.2平板研究三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界测试、结果见表5。三聚磷酸盐和焦磷酸盐的质量浓度分别为0.2g/100mL和0.3g/100mL时，均可产生2.0mm抑菌圈。

表5 三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界测试Table 5 Critical antimicrobial concentrations of pyrophosphate and trimetaphosphate mm

出口虾仁多聚磷酸盐的检测结果是以五氧化二磷含量计算的。因此，本研究将三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界质量浓度换算为以五氧化二磷计。这两种盐的抑菌效果临界值以P2O5计分别为1157.56mg/kg和1601.43mg/kg。

2.3 焦磷酸盐和三聚磷酸盐交互作用对抑菌效果的影响

不同焦磷酸盐和三聚磷酸质量盐浓度有不同的抑菌效果，为了分析两种磷酸盐不同质量浓度配比对抑菌效果的影响，选取了3个不同质量浓度在Bs7.2平板上进行正交试验，各因素水平见表6。

表6 正交试验因素水平表Table 6 Factor and levels in the orthogonal array design

表7 正交试验结果Table 7 Orthogonal array design arrangement and experimental results

从表7可以得出，三聚磷酸盐的质量浓度为0.4g/100mL、焦磷酸盐的质量浓度为0.6g/100mL时，其抑菌效果最强，抑菌圈宽度为5.6mm；三聚磷酸盐的质量浓度为0.2 g/100mL、焦磷酸盐的质量浓度为0.3g/100mL时，抑菌圈宽度为2.3mm，即两者同时作用时，抑菌圈并非会成倍增长，而是在单独作用的基础上有所增强；三聚磷酸盐质量浓度为0.2g/100mL，焦磷酸质量浓度为0.15g/100mL时，产生2.0mm抑菌圈；三聚磷酸盐质量浓度为0.1g/100mL、焦磷酸盐质量浓度为0.3g/100mL时，产生2.2mm抑菌圈，表明当二者有一种质量浓度达到临界浓度，就能产生抑菌阳性作用。

3 结 论

目前，对于多聚磷酸盐已有较多的研究，但国内的研究大多是基于其对肉品质的改善[2,12]或用离子色谱法测定含量[13-14]，国外已有针对多聚磷酸盐对金黄色葡萄球菌[5]以及蜡状芽孢杆菌[6]抑菌效果的研究，但没见多聚磷酸盐对枯草芽孢杆菌以及滕黄微球菌抑菌作用的相关报道。本实验选用了两种微生物法常用菌种，并考虑到培养基pH值对抑菌效果的影响，采用了四平板法对多聚磷酸盐抑菌效果进行研究。结果表明，Bs7.2平板上磷酸盐的抑菌效果最为明显，其他平板上只有三聚磷酸盐和焦磷酸盐在高质量浓度情况下才表现出抑菌作用。

对多聚磷酸盐的4种主要成分抑菌效果研究发现，主要抑菌成分为三聚磷酸盐和焦磷酸盐。通过进一步研究表明，在质量浓度分别为0.2g/100mL和 0.3g/100mL时，产生2mm抑菌圈，即抑菌效果呈阳性。表明当二者有一种质量浓度达到临界浓度，就能产生抑菌剂阳性作用。将三聚磷酸盐和焦磷酸盐抑菌效果临界质量浓度换算为以五氧化二磷计分别为1157.56mg/kg和1601.43mg/kg。因此对水产品进行多聚磷酸盐理化检测后，当三聚磷酸盐和焦磷酸盐含量超过临界数值时，存在抑菌剂超标潜在风险；当水产品检测出抑菌剂阳性时，三聚磷酸盐和焦磷酸盐含量可能偏高，则存在多聚磷酸盐含量超标的潜在风险。

综上所述，本实验采用微生物法对多聚磷酸盐的抑菌效果检验，操作简便、具有很大的广泛性和可操作性，有助于突破国外技术壁垒。

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Antimicrobial Effect of Polyphosphate Additives in Fishery Product

SHEN Biao1，HU Xing-juan1，XU Jun-hui1，BEI Wen-lian1，WU Zu-fang2
(1. Zhoushan Eentry-Exit Inspection and Quaratine Burea, Zhoushan 316000, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

TS254.7

A

1002-6630(2010)21-0054-04

2010-02-22

浙江省科技厅重大科技专项(2008C12076)

沈飚(1967—)，男，高级工程师，本科，主要从事微生物与食品安全研究。E-mail：sb@zs.ziq.gov.cn