关丽杰, 杨 迪, 谭国梁

(沈阳化工大学环境与生物工程学院,辽宁沈阳 110142)

黄瓜灰霉病拮抗放线菌的筛选

关丽杰, 杨 迪, 谭国梁

(沈阳化工大学环境与生物工程学院,辽宁沈阳 110142)

从辽宁、北京等不同地区采集土壤样品 25份,采用平板稀释分离法得到放线菌,通过抑菌圈法筛选获得对黄瓜灰霉病病原菌 (Botrytis cinereaPers.)有抑制作用的拮抗放线菌.采用牛津杯法对 28株拮抗菌发酵液进行复筛,抑菌圈直径≥15 mm的拮抗菌有 16株,其中 4株抑制作用明显,抑菌直径分别为:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和 57.9 mm.

灰葡萄孢菌; 拮抗菌; 筛选

由灰葡萄孢菌 (Botrytis cinereaPers.)引起的植物灰霉病目前已成为茄果类、瓜类、葱韭类、浆果类等多种果蔬作物生产的主要限制因素[1].20世纪 70年代以来,相继采用多种化学杀菌剂控制此病的危害,但由于该病原菌遗传变异大,适应性强,已经产生了抗药性[2-4].

放线菌作为一种具有丰富资源的微生物类群,其产生的抗生素及其他次生代谢物质在农作物病虫害生物防治方面具有重要作用,是具有应用价值和经济价值的一类微生物,在植物病虫害生物防治中具有开发应用前景[5-6].近 10年来从微生物中发现的新活性物质 902个,其中放线菌产生的有 668个,占 74%.不仅如此,放线菌还产生其他各种工农业有用的产品,如醇制剂等.此外,放线菌还可以合成淀粉酶、纤维素酶、氨基酸及维生素等多种有用的代谢产物.

利用放线菌产生的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治,具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点[7-8].放线菌作为最早应用到生物防治中的微生物,由于其有很强的分解纤维素、石蜡、琼脂、角蛋白和橡胶等复杂有机物的能力,故它们在自然界物质循环和提高土壤肥力等方面有着重要的作用.随着科技的发展,拮抗放线菌必将会广泛应用于微生物农药的研制和生产.我国幅员辽阔,地形、气候复杂,生态多样,放线菌的种类与资源比其他国家更非富,亟待深入研究与开发.本文通过抑菌圈法从土壤样品中筛选得到了对黄瓜灰霉病病菌有强烈抑制作用的放线菌菌株.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样来源

从辽宁、北京、河北、黑龙江、内蒙古等省蔬菜地、森林土壤中随机采集土样 25份.

1.1.2 供试菌种

黄瓜灰霉病病菌 (B otrytis cinereaPers.),由沈阳化工大学生物工程教研室分离并保存.

1.1.3 发酵培养基

培养基 1:淀粉 4.7 g,花生粉 2.2 g,酵母粉0.2 g,(NH4)2SO40.27 g,CaCO30.27 g,NaCl 0.27 g,pH=7.2.

培养基 2:淀粉 4.7 g,(NH4)2SO40.4 g,花生饼粉 3.3 g,CaCO30.4 g,NaCl 0.4 g,pH=7.0.

培养基 3:花生饼粉 2.5 g,淀粉 5.0 g,酵母粉 0.08 g,葡萄糖 0.02 g,(NH4)2SO40.08 g, CaCO30.32 g,NaCl 0.2 g,pH=7.0～7.2.

培养基 4:黄豆饼粉 3 g,玉米粉 2 g,葡萄糖2 g,(NH4)2SO40.4 g,CaCO30.4 g,K2HPO40.02 g,pH=7.0～7.2.

培养基 5:葡萄糖 3 g,玉米面 3 g,黄豆饼粉3 g,(NH4)2SO40.4 g,MgSO40.04 g,酵母膏 0.4 g,pH=7.0～7.2.

培养基 6:麸皮 1 g,淀粉 1.33 g,葡萄糖 0.67 g,NaCl 0.05 g,MgSO40.05 g,K2HPO40.05 g,Fe-SO40.005 g,KNO30.1 g,pH=7.2～7.4.

1.2 实验方法

1.2.1 放线菌的分离与纯化

采用稀释分离法处理采集的土壤样品.培养基为高氏 1号琼脂培养基.具体操作如下:

称取研细的分离土样 5 g,加入盛有 45 mL灭菌水的三角瓶中,充分振荡 10 min,吸取 1 mL混悬液,用无菌水梯度稀释.选择 10-3、10-4和10-5三个浓度的悬浮液 0.1 mL放到培养基上,用涂布棒涂匀,然后将培养皿倒置于 28℃恒温培养箱内培养 4～10 d,每天进行观察并挑选菌落形态各不相同的菌株及时转接到斜面上培养,并编号保存.

1.2.2 拮抗放线菌的初筛

以黄瓜灰霉病病菌为靶标,采取抑菌圈法进行拮抗放线菌筛选.

将活化的黄瓜灰霉病菌制成孢子悬液 (光学显微镜 20×40倍下,80个/视野),吸取 15 mL加入 250 mL熔融态 PDA培养基,制成混菌平板,等距离放置直径 7 mm的放线菌菌块,28℃恒温培养 4 d后十字交叉法测量抑菌圈直径.抑菌圈直径≥15 mm的菌株进入复筛.

1.2.3 拮抗放线菌的复筛

复筛采用牛津杯法.混菌平板上等距离放置无菌牛津杯,加样量 200μL,28℃恒温培养 3 d,十字交叉法测量抑菌圈直径.抑菌圈直径≥15 mm菌株重复发酵,测定抑菌效果.

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的分离与纯化

从辽宁、北京、河北、黑龙江、内蒙古等省蔬菜地、森林土壤中随机采集土样 25份,采用稀释分离法得到放线菌 521株.将这些菌株在高氏一号斜面上培养,4℃保存,备用.

2.2 拮抗放线菌的初筛

活体抑菌实验表明,抑菌圈直径≥15 mm的菌株共有 28株 (见表 1).

表 1 放线菌活体对黄瓜灰霉病的抑菌活性Table 1 Inhibition of antagonisisticactinom ycetestoBotrytis cinerea

2.3 拮抗放线菌的复筛

28个菌株经 6种不同培养基发酵后,抑菌实验结果表明:有 16株菌在其合适的发酵培养基中发酵后,发酵液有明显的抑菌活性,抑菌圈直径≥15 mm,且清晰透明(见表 2,图 1).

表2 不同发酵培养基的拮抗菌发酵液对病原菌的抑菌活性Table 2 The inhibition effect of the fermented broth from the different cultured media againstBotrytis cinerea

图 1 拮抗菌发酵液对黄瓜灰霉病病菌的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of the fermented broth againstBotrytis cinerea

其中菌株 7-16、7-29、13-25和 7-37的发酵液抑菌活性较高,抑菌直径分别为:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和 57.9 mm.

3 结论与讨论

实验通过抑菌圈法从 521株放线菌中初筛得到对黄瓜灰霉病有拮抗作用的菌株 28株;采用牛津杯法对 28株拮抗放线菌株的 6种不同培养基发酵液进行复筛,16株拮抗菌的发酵液对病原菌有抑制作用,其中 4株抑制作用明显,其抑菌圈直径分别为:60.2 mm、59.6 mm、58.7 mm和57.9 mm.其抑菌圈直径均大于 57 mm,这将为今后黄瓜灰霉病生防制剂的开发奠定基础.

放线菌分布广泛,形状差别大,没有普遍使用的分离方法和培养基,固从样本中分离的放线菌远低于实际数量.进行放线菌资源开发,获得新菌种是必要条件之一,分离方法的研究显得越发重要,寻找新思路,改进分离筛选方法,是目前放线菌研究面临的重大问题之一.

[1] 杨燕涛.国内保护地蔬菜灰霉病侵染规律及防治技术研究进展[J].农药,2003,42(l):6-10.

[2] 周明国,叶钟音,杭建胜.对多菌灵具有抗性的草葛灰霉病菌菌株形成与分布研究[J].南京农业大学学报,1990,13(3):57-60.

[3] 丁中,刘峰,王会利,等.番茄灰霉菌的多重抗药性研究[J].山东农业大学学报,2001,32(4):452-456.

[4] 纪明山,祁之秋,赵平,等.番茄灰霉病菌对崛霉胺抗药性的试验 [J].沈阳农业大学学报,2002,33 (5):345-347.

[5] Forster S M.O rangic Components Process[J].Soil Science,1969,33:420-423.

[6] V an A rsdall R T,Frantz C.Potential Role of Farm er Cooperatives in Reducing Pest Risk:Final Report [EB/OL].(2001)[2009-12-7].http://www. pesp.org/2000/ncfcooifinal.htm.

[7] CoyierD L,Covey R P.Tolerance of Erw inia Am ylovora to Streptom ycin Sulfate in O regon andwashington[J].Plant D is.Rep.,1975,59:849-852.

[8] 黄昌华,郭崇明.B-HCH菌株发酵滤液对植物病原真菌的作用 [J].中国生物防治,1996,12(3): 107-109.

Screening ofAntagonistic Actinomyces againstBotrytis Cinerea Pers.

GUAN L i-jie, YANG D i, TAN Guo-liang
(Shenyang U niversity of Chem ical Technology,Shenyang110142,China)

Streptomyces strains w ere isolated from25soil samples collected from L iaoning.U sing zone of inhibition as the screening m ethod,Streptom yces strains that had inhibition of antagonistic actinom ycetes on Botrytis cinerea w ere obtained.O xford cup m ethod was adopted to re-screen28Streptom yces strains.16Streptm yces strains had diam eter of inhibition zone≥15mm.4antagonisistic actinom ycetes had m ore inhibition,and their diam eter of inhibition zone w ere:60.2mm,59.6mm,58.7mm and57.9mm, respectively.

Botrytis cinerea Pers.; antagonistic actinom yces; screening

Q815

A

1004-4639(2010)03-0219-03

2009-12-05

关丽杰(1968-),满族,女,辽宁沈阳人,副教授,博士,主要从事植物保护产品与安全评价以及植物病理学方面的研究.