张 存，王一成，孙小梅，俞元明，袁秀芳，叶伟成，刘蔓雯

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江省湖州众旺禽业有限公司，浙江 湖州 313014;3.桐乡市乌镇镇农业经济服务中心，浙江 桐乡 314501)

1990年代以来，高致病性禽流感 (avian influenza)H5N1亚型的变异毒株可以导致鸭和番鸭发病死亡，疫苗免疫已经成为该病防控的主要措施之一［1］。在研究工作和畜牧生产上必须开展大量的鸭和番鸭等水禽禽流感抗体检测和监测以评价疫苗免疫效果，血凝 (HA)和血凝抑制试验(HI)是最常用的方法。我国检测高致病性禽流感HI抗体的标准方法以鸡红细胞作为HI试验的凝集抑制指示细胞［2］，在检测水禽血清抗体时，常常出现非特异性凝集现象，干扰检测结果的判定［3］。因此我们开展了禽流感抗原凝集鸭和番鸭红细胞特性的检测、不同 (品)种鸭红细胞与血清交叉凝集试验，确定了樱桃谷鸭红细胞代替鸡红细胞进行HI试验，并和RDE处理等方法进行了比较。

1 材料和方法

1.1 抗原和血清

高致病性禽流感 HI抗原 (批号2005061104)和阳性血清由哈尔滨兽医研究所生产。番鸭、樱桃谷肉鸭和麻鸭血清采集自杭州市华东家禽交易市场，每种4～6群，每群随机采集8～10只。

1.2 红细胞 (RBC)悬液的制备

采集非免疫3只成年伊莎公鸡或者樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭血液，与等量阿氏液 (葡萄糖20.5 g·L－1，柠檬酸钠 8 g·L－1，柠檬酸 0.55 g·L－1，氯化钠 4.2 g·L－1，pH 值 6.1)混合后，以 PBS(0.01 mol·L－1，pH 值 7.2)洗涤 3～4次以除去血浆和白细胞，每次均以1 000 r·min－1离心 10 min，红细胞沉淀以 PBS配置成1%的悬液［2］。

1.3 血清受体破坏酶 (RDE)处理

按文献方法处理麻鸭、番鸭和樱桃谷肉鸭血清各20份，以鸡红细胞进行HI试验，并与鸭红细胞作对比。RDE处理鸭血清的具体程序为:0.3 mL RDE(由浙江省疾病防控中心卢亦愚教授惠赠)与0.1 mL血清混合，37℃水浴过夜，56℃ 30 min灭活，再加入0.6 mL PBS使血清稀释为1∶10。

1.4 血凝和血凝抑制试验方法

按照文献［2］操作。结果判定:血凝被完全抑制的血清最大稀释度为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度的倒数即为HI试验的效价。

2 结果和分析

2.1 AIV抗原对鸡鸭红细胞的凝集效价

以鸡红细胞 (CRBC)、番鸭红细胞(mDRBC)、樱桃谷鸭红细胞 (yDRBC)和绍兴鸭红细胞 (sDRBC)进行HA试验，结果表明，H5亚型AIV标准抗原对4种家禽的红细胞凝集效价完全一致，均为8log2(表1)。

表1 AIV H5N1抗原凝集鸡鸭红细胞效价比较

2.2 鸭血清对鸡红细胞和鸭红细胞的凝集比较

将4个番鸭血清样品、6个麻鸭血清样品、5个樱桃谷肉鸭血清样品和2个AIV标准阳性血清(鸡)倍比稀释后与红细胞悬液等量混合，室温保持30 min观察红细胞凝集现象。结果发现4只番鸭血清、6个麻鸭血清中有3个样品与CRBC出现1～3孔 (2～8倍稀释)凝集或者可疑凝集，樱桃谷肉鸭血清未出现凝集CRBC的现象。而鸡的血清可以凝集 yDRBC，即使16倍稀释后也可出现凝集。番鸭、麻鸭、樱桃谷肉鸭血清与yDRBC混合后均未见到凝集现象 (表2)。因此，以鸡红细胞测定番鸭、麻鸭血清或者以鸭红细胞测定鸡血清的AIV HI效价将会出现非特异性凝集的干扰，可以使用yDRBC代替CRBC测定番鸭、麻鸭和樱桃谷鸭的AIV HI抗体。

此外，以yDRBC测定番鸭、麻鸭禽流感的HI效价与本种动物红细胞测定的效价一致，未见差别。

表2 鸭血清对鸡、樱桃谷鸭红细胞的凝集效果

2.3 yDRBC测定鸭血清 HI抗体与 RDE处理的比较

绍兴鸭、樱桃谷鸭和番鸭血清各20个样品经过RDE处理后以 CRBC进行 HI试验，同时以yDRBC进行测定，检测结果 (表3)显示:(1)樱桃谷鸭和番鸭血清样品符合率 (以±1个滴度视为符合)均达到100%，绍兴鸭样品符合率为80%;(2)2种方法检测的20个样品平均滴度相差樱桃谷0.2log2，番鸭0.1log2，绍兴鸭差别最大为0.75 log2;(3)对于高抗体滴度的血清样品检测结果，2种方法差异较小，低抗体样品稍大。此外，即使经过 RDE处理，沉底的红细胞 (不凝集)流动性仍然很差，终点判定较为困难，而使用樱桃谷鸭红细胞可以容易地根据红细胞的流动性来判定结果。

表3 2种检测鸭AIV 抗体血凝抑制试验方法比较

2.4 RDE处理和CRBC吸附对鸭血清HI检测结果的影响

以yDRBC检测鸭血清AIV HI抗体水平，与经过RDE处理和CRBC吸附后的检测结果相比，绍兴鸭HI抗体平均滴度基本一致，而樱桃谷鸭和番鸭血清分别高0.7log2和0.8log2，因此以 yDRBC进行HI试验检测鸭血清，其敏感性略高于CRBC。鸭血清即使经过CRBC吸附处理，仍然不能完全消除其对CRBC的非特异性凝集作用。

表4 鸡红细胞吸附对鸭血清HI抗体检测结果的影响

2.5 上市鸭群部分血清样品H5 HI滴度分布

对市场采集的部分肉用鸭高致病性禽流感抗体进行了检测，结果 (表5)显示:绍兴鸭公鸭、樱桃谷肉鸭和番鸭的H5N1亚型禽流感HI抗体合格率 (≥4log2)分别为100%、98%和100%，平均滴度分别为 5.94log2、5.1log2和 6.82log2，表明禽流感疫苗免疫效果很好，上市时抗体合格率几乎达到100%。

表5 上市肉鸭H5N1抗体检测分布和合格率

3 小结与讨论

HA和HI试验是我国检测禽流感抗体的标准方法，在科研、教学和生产上广泛采用。禽流感病毒表面的HA蛋白可以和动物红细胞表面的受体结合引起红细胞凝集，因此可以根据阻断这种凝集红细胞的血清稀释度来判定血清中抗体的含量。

不同动物的血清和红细胞之间可能存在影响凝集的因素［3］，如鸡红细胞和鸭血清就会出现非特异性的凝集，相反鸭红细胞和鸡血清之间也会出现非特异性的凝集现象。因此为了保证HI试验结果的可靠性，必须消除血清中非特异性的影响因子。RDE处理待检血清一般可以消除异种动物血清的非特异性凝集因子，但RDE处理方法耗时、昂贵，不适合大量检测;将血清以红细胞吸附后进行HI试验，但非特异性凝集因子消除不完全。本试验对麻鸭、樱桃谷肉鸭和番鸭血清与红细胞进行了交叉凝集试验，发现同种动物的红细胞与血清间不存在非特异性凝集现象，这和张评浒等［3－4］的研究结果一致。但在禽流感的实际监测过程中，存在番鸭、肉鸭以及蛋鸭等不同种或品种，需要采集和使用不同 (品)种鸭的红细胞，如果能够使用一种红细胞即可检测各 (品)种鸭的 HI抗体，将增加HI方法的易用性和便利性，试验分别比较了樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭之间血清和红细胞的交叉凝集现象，结果发现鸭种间不存在血清和红细胞的交叉凝集现象，可以使用鸭红细胞悬液进行鸭、番鸭血清抗体的HA和HI试验。

采用樱桃谷鸭红细胞检测绍兴鸭、樱桃谷鸭和番鸭血清，能够消除鸭血清非特异性凝集鸡红细胞对HI抗体检测结果的影响，凝集图象清晰，可以通过红细胞的流动性来判定结果 (即将血凝板倾斜45o角并保持5 s，不凝集的沉底红细胞会流动)结果易于判定，减少了HI试验结果判定的主观性;而以鸡红细胞检测鸭和番鸭血清的HI抗体，即使血清经过RDE处理、红细胞吸附，仍然不能完全消除这种非特异性凝集作用，不凝集的红细胞也无流动性，在终点判定时比较困难，干扰结果的判定。检测不同品种鸭和番鸭的血清抗体仅仅使用樱桃谷肉鸭红细胞即可，而不必制备多种鸭红细胞，在水禽禽流感抗体检测和监测中具有重要的应用价值。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.北京.北京农业大学出版社，2002.

［2］GB/T 1836－2003高致病性禽流感诊断技术 ［S］.

［3］张评浒，唐应华，仇旭升，薛峰，等.不同家禽红细胞悬液对禽流感血清抗体检测的影响［J］.中国兽医科技，2005，35(4):267－271.

［4］李金华，叶伟成，王一成，等.雏鸭禽流感母源抗体消长动态测定［J］.浙江畜牧兽医，2008(2):1－2.