姚红燕，张 庆，张松柏

(1.浙江省宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040;2.宁波市农技推广总站，浙江 宁波 315040)

草莓种植在宁波特色农业产业中占有重要的地位，2005－2006年全市种植面积已达0.15万hm2，产值达到2.5亿多元。同时，通过速冻、脱水和制作草莓酱等等深加工技术，草莓产品正成为宁波市重要出口加工农产品之一，不但进一步提升了产品的附加值，还为农业增效和农民增收作出了较大贡献。但是，目前宁波市草莓夏秋季育苗中苗期炭疽病的发生十分普遍，对秧苗素质和繁殖能力造成了严重影响，特别是正在推广的优质、高产新品种红颊发病尤其严重，已成为品种推广的主要制约因子。为探明宁波草莓炭疽病的病原类型和发生特点，提高病害防治技术水平，我们对宁波主要基地草莓炭疽病病株进行了病原菌分离与鉴定，并对优势菌株胶孢炭疽菌的生物学特性开展了研究。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

草莓炭疽病病株采自宁波奉化尚田镇、鄞州下应镇、鄞州邱隘镇和慈溪浒山镇草莓基地。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离

组织分离法:从田间病株样本中选取不同发病部位的典型病斑组织，在病健交界处取样。叶片样品剪取5 mm×5 mm左右的小块，匍匐茎和根茎处切成0.5 cm左右小段，根部剖开后取开始褐变的组织切成同样长度的小段。采用0.1%升汞进行表面灭菌，处理时间2～3 min，之后用灭菌水洗3次，每次1 min，置于25℃下，于PDA培养基上黑暗培养。

冷冻分离法:选取健康、无病斑和物理损伤的植物组织，放在塑料袋中，敞口置于－20℃冰箱内，冷冻 1.5～2 h后取出，在含 Tween 20的0.525%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min表面灭菌，期间摇动数次。之后用灭菌水充分洗涤3次，每次1 min左右，待组织上的水分晾干后，置于以灭菌滤纸保湿的托盘中，用保鲜膜密封，23～25℃持续荧光光照培养，3～7 d可产生炭疽的分生孢子团，在实体显微镜下用灭菌的拨针挑取孢子移入改进后的炭疽选择性培养基 (CIM)上，在25℃下黑暗培养。

1.2.2 光照对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

在培养7 d的菌落边缘，用打孔器打取直径为0.5 cm的菌饼，移入15 mL PDA平板上，25℃下，分别置于24 h光照、12 h、12 h光暗交替和24 h黑暗3种光照处理下培养，各处理重复3次，7 d后测量菌落直径，每皿加10 mL无菌水冲洗下平板中的孢子，用血球计数板进行计数。将洗下的孢子稀释到10×10倍镜下30个左右·视野－1后滴到载玻片上2滴，分别置于上述光照条件下，25℃培养，24 h后镜检孢子萌发率，每处理重复3次。

1.2.3 温度对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

在培养7 d的菌落边缘，用打孔器打取直径为0.5 cm的菌饼，移入15 mL PDA平板上，分别置于10，15，20，25，30，35，40℃的恒温培养箱，黑暗条件下培养，设3次重复，7 d后测量菌落直径，每皿加10 mL无菌水冲洗下平板中的孢子，用血球计数板进行计数。孢子萌发率计数方法同上。

1.2.4 pH值对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

用磷酸盐缓冲液配制培养基，然后用1 mol·L－1NaOH 和 1 mol·L－1HCL 调节 PDA 培养基的pH值为5，6，7，8，9，10，11等6个梯度，分别制成15 mL PDA平板。移入直径0.5 cm的菌饼，于25℃下黑暗培养，7 d后测量菌落直径，每皿加10 mL无菌水冲洗下平板中的孢子，用血球计数板进行计数。孢子萌发率计数方法同上。

1.2.5 病菌分生孢子致死温度测定

每支灭菌试管中注入3 mL配制好的孢子悬浮液，每个处理3次重复，分别置于45，50，55，60℃的恒温水浴锅内，处理5，10和15 min后取出，迅速放入冷水中冷却。再置于PDA培养基上，于25℃、黑暗中培养3 d，以未处理的孢子悬浮液作对照。

2 结果和分析

2.1 菌株的分离与鉴定

采用2种方法对4地具典型发病症状的病株样本进行分离后发现，从茎、叶部分离到的病菌有:炭疽病菌 (Colletotrichumsp.)、拟茎点霉(Dendrophoma obscurans)、镰刀菌 (Fusariumsp.)、链隔孢 (Altemariasp.)和一种未知菌。从根部分离到的病菌有:炭疽病菌 (Colletotrichumsp.)、镰刀菌 (Fusariumsp.)和一种未知菌 (表1)。

表1 各地病株样品的病菌分离结果

对分离到的炭疽病菌进一步进行培养，通过分生孢子大小、性状和菌落特性等鉴定，确定其中5个为草莓炭疽菌 (Colletotrichum fragariae)，8个为胶孢炭疽菌［Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)］。

草莓炭疽菌的特征:菌落白色至灰白色，气生菌丝平坦，刚毛有或无。分生孢子倒卵形，无色，单胞大小14.6～20.5(17.0)μm×5.2～6.9(6.1)μm，不易产生有形态，一般无子囊壳。

胶孢炭疽菌的特征:菌落灰白色至深灰色，气生菌丝平坦，絮状，菌落随菌龄增长背面呈不均匀白色至灰色至黑色，刚毛有或无。分生孢子柱形，两端钝圆，无色，单孢大小13.8～18.7(16.3)μm×5.6～7.9(6.8)μm，有2个油球，易产生有形态，有子囊壳。

2.2 光照对胶孢炭疽菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

3种光照处理下胶孢炭疽菌的菌丝生长量、产孢量和孢子萌发率比较结果显示，在全暗光培养的条件下菌丝生长量、产孢量和孢子萌发率均达到最大值。且其中的菌丝生长量和孢子萌发率与全光照、光暗交替处理间均存在显著性差异;产孢量与全光照处理间存在显著性差异，与光暗交替处理间不存在显著性差异 (图1、2、3)。可见全暗光培养对菌丝生长、产孢和孢子萌发有利，尤其是对产孢量影响最大。

图1 光照对胶孢炭疽菌菌丝生长的影响

图2 光照对胶孢炭疽菌产孢数量的影响

2.3 温度对胶孢炭疽菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

温度对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响表现不太一致。菌丝生长量在25℃时表现最大值，且与其它处理间存在显著性差异 (图4);产孢量在30℃时表现最大值，其次是25℃，但两者间不存在显著性差异，10℃、40℃和45℃时几乎没有孢子产生 (图5);孢子萌发率在25℃时达到最大值，其次是20℃，但两者间不存在显著性差异，其余处理的孢子萌发率均很低，45℃时没有孢子萌发 (图6)。总的说来，20～30℃是最适宜菌丝生长、产孢和孢子萌发的温度区间;25℃最适宜菌丝生长和孢子萌发，30℃最适宜产孢。

图3 光照对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响

图4 温度对胶孢炭疽菌菌丝生长的影响

图5 温度对胶孢炭疽菌产孢数量的影响

图6 温度对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响

2.4 pH值对胶孢炭疽菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

pH值对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响表现也不一致。菌丝在pH值5～11范围内均可生长，pH值为7时表现最大值，与其余处理间存在显著性差异，pH值11时生长最差 (图7);产孢量在pH值9与10时最大，pH值11时最小 (图8);孢子萌发率在pH值9时最大值，与其余处理间存在显著性差异，其次是 pH值10(图9)。总的来说，pH值中性条件有利于菌丝生长，而产孢量和孢子萌发适宜偏碱的条件。

图7 pH值对胶孢炭疽菌菌丝生长的影响

图8 pH值对胶孢炭疽菌产孢数量的影响

图9 pH值对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响

2.5 胶孢炭疽菌分生孢子致死温度测定

胶孢炭疽菌的分生孢子在45℃处理5 min和10 min后均能萌发，而在45℃处理15 min后不能萌发。所以分生孢子致死温度为45℃处理15 min。

3 小结与讨论

草莓炭疽病的病原菌有3种:草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)、胶 孢 炭 疽 菌［Colletotrichum gloeosporioides(Penz.)］和尖孢炭疽菌 (Colletotrichum acutatum)。通过对来自4个草莓产区的80个样品的分离、鉴定，共分离到草莓炭疽菌5个，胶孢炭疽菌8个，未发现尖孢炭疽菌。研究中还发现，即使症状明显的组织，也未必能分离到炭疽病菌;在发病叶片上分离到拟茎点霉菌较多，田间易把此菌引起的叶斑病症状误认为炭疽病的病斑;根部的样品中分离到大量的镰刀菌，所以，草莓苗期的根部病害防治也是至关重要的。

试验发现，胶孢炭疽菌在10～45℃范围内均可生长，这与雷百战对葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioide)的研究结果基本一致［1］，其菌丝生长、产孢和孢子萌发的的适宜温度分别为25℃、30℃和25℃;对pH的适应范围较广，生长的最适pH值为7，产孢的最适pH值为9，孢子萌发的最适pH值是9，可见中性利于菌丝生长，偏碱性利于产孢和孢子萌发，此结果与岑贞陆等［2－3］对大青枣及荔枝炭疽病菌的研究结果略有不同;黑暗对菌丝生长、产孢和孢子萌发均有利。

致死温度测试结果显示，胶孢炭疽菌分生孢子的致死温度为45℃处理15 min，比张海英等［4］的研究数据略低。

［1］雷百战，李国英.新疆葡萄炭疽病病原的鉴定及其生物学特性的研究 ［J］.石河子大学学报，2003，22(4):298－300.

［2］岑贞陆，谢铃，黄思良.大青枣炭疽病的病原鉴定及其生物学特性研究 ［J］.中国农业科学通报，2002，18(3):48－50.

［3］刘爱媛.荔枝炭疽病菌生物学特性的研究 ［J］.植物病理学报，2003(4):313－316.

［4］张海英，张明会，刘志恒.草莓炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究 ［J］.沈阳农业大学学报，2007，38(3):317－321.