邓晓娟,常剑渊,肖层林,张海清

(湖南农业大学农学院,长沙 410128)

两系法杂交水稻是我国继三系法杂交水稻之后作物遗传育种上的又一次重大技术革新[1～3]。与三系法杂交水稻比较,两系法的最大优越性在于能自由配组,不受“三系法”的恢保关系制约,选配强优组合几率大。生产实践证明,两系法杂交稻比三系法同熟期的杂交水稻增产 10%左右,杂种优势表现更为明显[4],因此,两系法杂交水稻在近几年内得到了迅速推广。2002年两系杂交水稻种植面积已扩大至 260万公顷,大约占杂交水稻总种植面积的18%。但由于光温敏不育系是一种生态遗传不育系,其育性表达除了受育性基因的本质影响外,还在很大程度上受生态因素,特别是光温因素的调控。在自然界,光周期的变化有规律可循,但温度的变化因受到其它许多因素的影响而在年度间同一时间内的变化较大,特别是夏季异常低温的来临并不以人们的意志为转移。在生产实践中两系杂交水稻制种易受异常气象条件干扰而出现种子纯度不达标,从而影响了种子的使用价值[5]。如1989年7月下旬长江流域夏季出现的异常低温,使一些籼型不育系发生了明显的育性波动,出现育性恢复,从而降低了制种种子纯度[6]。湖南 1993年、1996年、1999年也都因为异常的天气而出现种子纯度问题,遭受了较大损失,尤其1999年,制种面积较大,损失严重[7]。 2002年 8月中旬,江淮地区遇到了多年不遇的低温,培矮 64S等系列组合的制种母本出现了较大面积的育性波动现象[8]。2002年安徽省种子质量监督检验站对 58个两系籼稻制种样进行纯度鉴定,有 23个制种样杂株率超标,不合格率达40%。说明现在生产上使用的两系杂交水稻组合确实存在制种风险,遇到特殊年份,甚至会给种子企业带来难以承受的经济压力,这也极大地制约了两系杂交水稻的推广速度[9]。因此,如何确保两系杂交水稻种子纯度,仍是两系杂交水稻研究和应用中的一个重大课题。

1 影响两系杂交水稻制种纯度的主要因素

1.1 不育系育性转换起点温度偏高

不育起点温度的高低直接关系到制种的安全性问题。一般来说,育性起点温度越低,育性敏感安全期越长。上世纪 80年代,由于人们对水稻两用核不育系育性转换机理认识不够,当时只有“光敏不育系”概念,对不育系的选择、鉴定只考虑光照因素。1989年长江流域盛夏出现了低温,导致当时所有的所谓籼型“光敏核不育系”转为可育,从而产生了“温敏核不育系”概念。因此在 1989年前选育的籼型两用核不育系,如W6154S,W6111S,安农 S-1,KS-9等,育性转换起点温度在 25℃以上,在制种过程中容易遇上 25℃以下的气温,导致不育性波动,生产的杂交种子不能达到国家质量标准。90年代初期以后,我国选育出一批育性转换起点温度较低的两用核不育系,如培矮 64S,安农810S,香 125S,安湘 S,测 64S,准 S等 ,其育性转换起点温度在 23.5℃～24℃左右[10,11]。这些不育系在湖南水稻生产季节内能够找到安全的育性敏感期,制种风险大大降低。90年代后期选育出一批育性转换起点温度为 23.0～23.5℃的温敏核不育系,如株 1S,陆 18S等,其敏感期承受低温时间较长(22.5～23.0℃,4～6 d),不育性稳定,所配组合的种子在大面积生产中表现纯度高,从而得以迅速推广。2001年以来,我国选育出一批育性转换起点温度在 23℃左右的新不育系,如C815S,P88S,Y58S,湘陵 628S等,这些不育系承受低温时间较长,制种时不育性波动风险进一步降低。

1.2 不育系育性转换临界温度的“漂变”及同形可育株的产生

光温敏不育系繁殖若干代后不育起点温度明显升高,致使不育系种子完全不能用于制种,早期把这种现象称为起点温度的“遗传漂移”[12]。后来大多数学者把这种现象称为临界温度的“漂变”。导致两用核不育水稻起点温度“漂变”现象的根本原因是不育系育性转换起点温度是由多基因控制[13,14],如果这些不育系在繁殖过程中,按一般的常规良种繁殖程序和方法选种、留种,不育起点温度较高的个体因可育的温度范围较广,在自然条件下,结实率一般较高,因而在群体中的比例不断扩大,导致不育系群体育性转换起点温度上升,即出现不育起点温度的“遗传漂移”现象。

据考察,湖南、湖北、广西和安徽等省已通过技术鉴定的不育系都有类似的不育起点温度漂变的问题[15]。如衡农 S-1在 1989年技术鉴定后,未经提纯多代繁殖,至 1993年制种时出现 15%左右的可育株,这些植株的起点温度已达 26℃,自交结实率达 70%,使500 hm2制种失败[16]。当前国内两系杂交水稻生产中应用最广泛的光温敏核不育系培矮64S育性转换的临界温度在1991年通过省级鉴定时为23.3℃[17],在未提纯情况下经多代繁殖,不育系的育性转换温度逐代升高,1993年已上升到 24.2℃,1994年有些地方高达26℃左右[18,19],1996年制种时育性敏感期遇上连续 3 d日平均气温 23～24℃的天气,不育性产生了波动,其中出现了3%～5%的可育株,自交结实率达75%,致使部分制种基地的杂交种子报废。1990年湖南杂交水稻研究中心从湖北、福建、广东、江西等省征集 W6154S在湖南盛夏制种,发现起点温度极不一致,有的可育,有的不育,不育度也不尽相同。在长沙8月不育期间隔离栽培,完全不结实的单株不到 10%[20]。光温敏核不育系温度漂移将减少优良不育系的使用年限,加大制种风险。育性转换温度的稳定性是生产上应用的先决条件,如何从遗传上克服育性转换温度漂移现象是两系杂交水稻遇到的重要课题。

目前生产上应用的许多光温敏核不育系,在育性敏感期未遇上低于育性起点温度的情况下,在抽穗期出现生育期、株叶型和穗粒性状与不育系典型性相同,但正常开花散粉,结实正常的单株,称为同形可育株。同形可育株不仅本身结实率高,而且授粉给周围不育株而异交结实,导致制种的种子纯度下降。同形可育株产生的原因尚不清楚。

1.3 制种基地的选择和季节的安排不妥

由于光温敏不育系的育性转换受生态环境影响,因此制种基地的选择和季节的安排较三系制种更严格。研究表明,光温敏不育系的育性敏感期一般从雌雄蕊形成期至花粉母细胞减数分裂期,即幼穗分化的4～6期[21]。因此制种基地的选择和季节的安排必须保证制种用的温敏不育系在育性敏感期时段(幼穗分化4～6期)平均气温高于不育系的不育起点温度;对光温敏不育系来说,除了保证不育起点温度的要求外,育性敏感期间还要求保证育性转换临界光长的要求。

两系杂交水稻制种实践证明[22],在海拔 450 m以上的山区制种,不仅日均温较低,昼夜温差大,而且一旦遇上阴雨天气,温度下降快,容易造成不育系不育性的波动。此外,海拔较高的山区和丘陵区往往有山沟冷浸水、水库底层水灌入稻田,水温一般低于 24℃,易造成制种田局部的不育系育性波动,这种育性的波动不易被发现,给两系杂交种子纯度带来隐患。

湖南全年最高气温出现时期一般是 7月下旬至 8月上旬,在此之前,一般雨水较多,气温不够稳定,在此以后易出现日均温低于24℃的天气[23,24]。从90年代以来,两系杂交水稻制种因季节安排不适宜,导致制种失败的已有多例。1993年衡阳春制衡两优1号,6月底至7月初连续 5 d下雨,日均温降至 24℃以下,不育系育性敏感期未能安全通过。1995年永州春制培两优288,不育系育性敏感期遇上 6月中旬低温,杂交种纯度只有80%～90%。1996年在怀化地区夏制培矮64S系列组合,部分制种基地由于播种期安排不当(培矮64S于5月 5～15日播种),母本育性敏感期遇上 7月 15～17日连续3 d日均温低于24℃的天气,有部分杂交种子因纯度不合格而报废。1999年7月16～17日怀化地区又出现低于 24℃天气,少数制种基地因不育系育性敏感期安排不当,导致母本有自交结实现象。1999年8月下旬,湖南出现连续阴雨,日均温低于 24℃,部分两系秋制基地因不育系育性敏感期与低温期吻合,使制种未能成功。对具有长日光敏不育特性的不育系,如安排在短日照地域制种,将使不育系转向部分可育。

1.4 栽培管理措施不当

两系法杂交水稻制种常出现不育系后发高位分蘖穗自交结实现象,严重威胁制种纯度。产生这种现象的原因主要是不育系后期营养条件较好,如晒田控苗不够、母本花期早于父本等,导致后发高位分蘖正常生长发育,其育性敏感期遇上季节性低温即转换为可育。1992年在培矮 64S的分期播种试验中发现,5月 10日播种,8月上旬抽穗开花,自交结实率仅0.5%。该播期齐穗后又不断长出分蘖,9月上旬抽穗开花,部分花药开裂散粉,自交结实率达 22.6%[16]。

2 两系不育系的保纯措施

2.1 选育实用型光温敏不育系

许多学者提出解决制种风险问题的方法是选育不育起点温度低的两用核不育系[25],不育起点温度若能降到 23℃以下,在长江流域盛夏季节制种就能大大降低风险[26]。另有学者认为两系法杂交水稻能否大面积应用于生产,关键取决于两用核不育系是否具有较长的稳定不育期和能否大批量繁殖种子。因此,选育实用光温敏核不育系至关重要。所谓“实用”,是指不育系具有育性转换明显,制种风险低,自身繁殖可靠等特点。根据光温作用模式和育种实践,对实用不育系的育性制定了严格标准:a.不育起点温度要低(23℃以下);b.光敏温度范围要宽 (23～29℃);c.临界光长要短。袁隆平根据光温敏不育系育性转换与光温变化关系的基本规律,提炼出实用光温敏不育系的 3项具体指标,其中最关键的指标是不育起点温度必须低[27]。在这一技术策略的指导下,先后有一批不育起点温度低的不育系出现,如株1S,陆18S,GD21S,C815S等,这些不育系不育起点温度基本在23℃以下。但不育起点温度过低,由于受生理临界温度的影响,可育温度区间变窄,繁殖困难。因此有学者从降低不育系生理下限温度方面研究选育实用光温敏核不育系,提出了选育生理下限温度低和不育起点温度低的“双低”两用不育系的新思路[28]。陈良碧等人已筛选出不育临界温度22℃,生理不育临界温度 17℃的材料[29]。

根据不同地区生态条件的差异,确定选育实用型光温敏不育系的重点:长江流域应以光敏型为主兼顾光温互作型;华南地区气温高,日照相对较短,应以温敏型为主兼顾临界光长短的(13 h)光敏型;北方夏季日照长,秋季降温快,应以光温互作型为主。

2.2 控制不育系育性转换起点温度的遗传漂移

袁隆平[30]根据实用型光温敏不育系的特殊性,为了保证两系杂交水稻种子质量提出了“核心种子技术”,即生产上应用的实用不育系必须每年通过单株选择和严格的人控低温处理,筛选出不育起点温度仍保持稳定的种子繁殖、制种,如此形成良性循环,保证两系杂交水稻的纯度。目前应用核心种子技术已成功地将培矮 64S,香125S,安湘 S等不育系起点温度的漂移幅度控制在生产上允许的范围之内。湖南从1994年起用此程序和方法生产不育系核心种子、原种、原种一代,用原种一代制种,杂交种子纯度符合国家标准。但该方法在人工气候室处理生产核心种子,成本高、核心种子生产量也受限制[31]。

根据水稻光温敏核不育系“核心种子”生产原理和光温敏不育系的生长发育特性,刘爱民等提出了定向培养“三层穗”生产“核心种子”的新方法[32],即通过控制移栽叶龄、基本苗数和肥水管理,定向培育不育系抽穗历期长的“三层穗”,对第一层穗进行农艺性状典型性鉴定,选择标准单株;对第二层穗进行冷水处理造成育性波动,选择核心单株;对第三层穗进行冷水处理使之转向可育,获得核心种子。与人工气候室生产两系不育系核心种子比较,该生产程序有以下特点:生产成本低;选种圃群体大,可选出更多的核心株,核心种子生产量大;对不育系群体育性表现有更全面充分的认识,选择的核心株准确可靠[33]。

遗传杂合性是温度漂移的基本原因。因此,通过育种手段,快速纯合育种材料也是解决方法之一。花培育种是目前快速纯合育种后代的主要途径。花培育种具有遗传纯化快、选择效率高、遗传特性较稳定等特点[34],有研究[35]证实,花药培养对培矮 64S的遗传纯化是有效的。应用花培的方法已培育出光(温)敏核不育系浙农大14S,浙农大13S,1647S,M2S,Hs-1和 Hs-2等[36～40]。但在实际操作中,花培的诱变作用常使不育系产生无法控制的体细胞无性变异。

2.3 选择合适的制种基地并合理安排播种期

用籼型温敏核不育系制种,要从严把握温度(气温、水温)对母本育性敏感期的影响。对制种基地的选择和制种季节的安排,除了考虑土壤肥力、灌溉条件外,更重要的是气候条件,即不仅要有安全抽穗扬花的气候条件来保障制种产量,更要有安全可靠的温度条件来保障不育系育性敏感期的安全。肖层林等从气候条件、耕作制度以及水稻生产、制种的经济效益综合考虑,提出了湖南两系制种基地选择和季节安排的模式[16]。在海拔400 m左右的一季稻区或单、双季稻混栽区夏制,不育系育性敏感期安排在7月下旬至8月初,抽穗扬花期在 8月上、中旬;在湘中、湘南双季稻区可安排早秋制种,不育系育性敏感期在 8月上、中旬,抽穗扬花期在8月下旬。1993年以来,按此模式安排的两系制种都是成功的,保障了杂交种子的纯度。此外,无论何地何季制种,制种基地都要避开温度低于 24℃的冷水对育性敏感期的影响。

2.4 加强不育系育性检测和除杂

坚持用原种一代制种,并加强不育系育性检测和制种田除杂是确保制种纯度的重要技术措施。为了确保不育系种子和杂交种子的纯度,保证农户的根本利益,每年各级部门和种子企业都要做大量的纯度鉴定工作,将生产的不育系种子,经抽样带去海南岛用种植方法进行纯度的鉴定。小区种植鉴定是目前公认的最可靠、最准确的品种鉴定方法[41,42],能使水稻种子种性直接表现出来,其特点是较为直观、准确[43]。以种子、幼苗、叶、花、果实、花粉等组织器官的颜色、形态等农艺性状作为鉴定的观测指标,它适用于任何作物,只要熟悉待检品种的标样特征,就可以进行直观的鉴定[44]。

制种田除杂贯穿生育全过程。在苗期根据不育系秧苗的叶色、叶形、秧苗高低等典型形态特征去杂去劣,保证秧苗生长群体一致性。穗期是去杂的关键期,可根据母本株叶穗粒特征、株高、生育期等表现严格清除杂株。同形可育株从形态、株高、生育期等方面难以辨别,可在始穗期喷施“九二○”,对“九二○”反应特别敏感且不包颈、花药饱满呈金黄色的植株则为同形可育株,应在开花前除尽。齐穗后,对每块田地都要抽查检测,发现问题及时采取补救措施,把田间杂株率控制在万分之五以下。

由于人工去杂任务繁重,强度大,种子纯度依赖于技术人员的素质,为此育种家们设想并实现了将一些明显的标记与不育系选育相结合,将易于识别的标记转育到不育系中,育成带标记的不育系,根据标记的明显差异就可达到既方便去除不育系自交种子,保证大田杂种的纯度,又可简易鉴定杂种纯度的目的。根据标记在保纯、去杂中的作用原理不同,标记去杂法可分为致死标记、转基因标记和叶色标记三种。

致死标记,即水稻中存在对某些环境条件敏感的隐性选择致死基因,将其转育到不育系上,而将其对应的显性基因转育到其恢复系中,制种时可根据致死标记法去除育性不稳的不育系自交种子[45]。张集文等[46]将水稻光温敏雄性不育系W6154S辐射诱变,获得隐性单基因bel遗传的化学致死突变体 8077。该突变体的自交苗在苗期能被苯达松杀死,而其杂种 F1代对苯达松表现安全,且突变体性状对农艺性状无明显不良影响。

转基因标记,即通过转基因技术将对某种选择剂表现为抗性的基因导入不育系或恢复系,含有该基因的植株对特定的选择剂具备抗性,而没有该基因的混杂植株在选择剂处理后死亡,从而起到去杂保纯的作用。傅亚萍等[47]成功地将bar基因转入到两系不育系培矮64S中,为克服不育系育性不稳,并进一步实现杂交水稻机械化制种提供了一条新的途径。

上述两种方法均由于选择基因不带有植株形态上的可见变化,使得在将其转入其它不育系的过程中难以选择。

叶色标记去杂法是通过杂交或转基因技术将隐性叶色突变作为标记形状导入水稻不育系,带叶色标记的不育系在苗期表现出其特有的颜色,如黄色、紫色、白色、淡黄色等,而用其配制的杂种 F1为正常绿色,两者很容易地加以区别,这样在繁种时只要去除绿苗即可达到去杂的目的。制种时,在杂交稻秧苗移栽前,只要除去叶色标记苗即可彻底去除不育系自交结实的种子。因此,带叶色标记对于解决不育系繁殖和制种时机械或生物学混杂引起的种子纯度问题非常方便有效,不仅缩短鉴定周期,而且节省费用,对杂交水稻的生产有着极其重要的意义[48]。任光俊等[49]通过杂交和回交方法将水稻紫叶性状转入核不育系上,并取得初步结果。董凤高等[50]将隐性的淡绿叶色标记导入籼型光温敏核不育系上,获得了带叶色标记、且不育性较稳定的不育系M2s。舒庆尧等[51]利用诱发突变技术直接培育带叶色标记的两用核不育系,获得了一批苗期白化、黄化且后期能转绿的光温敏不育系突变体。宋克堡等从安农810S繁殖大田中发现一株淡黄叶突变体,选育成功淡黄叶标记不育系安农标810S[52]。该不育系叶色标记明显,表达稳定,利用叶色变异鉴别杂株的时间早(第一片完全叶)、周期长(全生育期)、效果好(100%),无负面影响。

叶色标记法是一种简单、方便、具有实际应用价值的去杂技术。但在实际中应注意四个原则[51]:标记性状明显,带标记和未带标记的幼苗易鉴别;标记性状要稳定,不易受环境影响;标记性状对杂种的产量等没有负效应;标记性状是隐性的。只有同时具备上述4个条件,叶色标记才能在产生中具有实际的应用价值。

2.5 定向培养母本整齐群体

两系杂交水稻制种,加强母本定向栽培,抑制迟发高位分蘖生长,培养整齐度高的多穗型母本群体,也是保证制种纯度的重要技术措施。母本要多用种、稀播培养带蘖壮秧,并插足基本苗;以基肥为主,少施或不施追肥,及时晒田,培养中等长势长相群体,从严抑制迟发高位分蘖的生长。在父母本花期预测时,若发现母本花期早于父本,不宜对母本采用偏施氮肥、深中耕、拔苞、割苗再生等措施进行花期调节,否则,将促进迟发高位分蘖生长。

3 展 望

由于两系法杂交水稻具有更为明显的杂种优势,其推广面积不断扩大。但由于光温敏不育系育性表达除受育性基因的影响外,还在很大程度上受光、温等外界环境条件的影响,常造成两系杂交稻种子纯度不达标,严重制约了两系杂交稻的推广速度。因此,确保两系杂交稻种子纯度问题还有待进一步的研究。笔者认为可以主要从以下几个方面着手:

(1)利用现代分子生物学技术与传统育种手段相结合,拓宽光温敏不育基因源,选育实用光温敏核不育系,降低两用核不育系不育起点温度。

(2)加强以核心种子生产为关键环节的光温敏核不育系的提纯和原种生产,控制不育系育性转换起点温度的遗传漂移,并坚持用原种一代制种。

(3)根据不育系育性转换温光特性,进一步探索制种基地的选择和制种季节的安排。

(4)加强制种全过程的不育系纯度和育性转换监测,探索及时高效的除杂防杂技术手段。

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