朱照辉，林 江，钱 军△ ，姚冬明，钱 震，王雅丽，肖高飞

(江苏大学附属人民医院:1.血液科;2.中心实验室;3.检验科，江苏 212002)

黑色素瘤优先表达抗原(preferentially expressed antigen of melanoma，PRAM E)是肿瘤相关抗原，在多种肿瘤细胞中高度表达，可作为一种肿瘤分子标志物用于微小残留病(minimal residual disease，MRD)监测[1-2]。Christina等[3]研究发现，PRAME基因启动子区低甲基化可能是其表达调控机制之一。本实验室建立了一种检测PRAM E基因低甲基化的EvaGreen荧光染料实时定量甲基化特异性PCR(RQ-MSP)法，并对急性髓系白血病(AML)患者进行了检测，证实该方法可用于AML患者初诊标本检测，并可用于随访标本MRD的监测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择18例(对照组)骨髓标本，其中11例取自正常捐献者，7例取自缺铁性贫血(IDA)患者。30例(AML组)患者骨髓标本来自本院血液科住院患者，诊断按FAB标准分类。未甲基化阳性对照为重亚硫酸氢盐修饰的AML患者的骨髓DNA，用去离子水作为阴性对照，甲基化阳性对照为经甲基转移酶(M.SssI)处理后再行重亚硫酸氢盐修饰的正常人骨髓DNA。

1.2 单个核细胞分离和基因组DNA制备 按本实验室常规方法提取骨髓单个核细胞;依据基因组 DNA提取试剂盒(Gentra)和DNA修饰试剂盒(Chemicon公司)操作指南提取基因组 DNA，进行DNA重亚硫酸氢盐修饰，-80℃保存备用。

1.3 方法

1.3.1 定性MSP 按参照文献[4]合成引物，PRAME基因未甲基化(U)MSP上游引物序列 5′-GTT GTA AGG ATG TTT TGA ATT GA-3′，下游引物 序列 5′-CCT ACA CCA CTA CCT AAA CCA TC-3′，扩增片段169 bp。参照基因 ALU 的上游引物序列 5′-TTA GGT ATA GTG GTT TAT ATT TGT AAT TTT AGT A-3′，下游引物序列5′-ATT AAC TAA ACT AAT CTT AAA CTC CTA ACC TCA-3′，扩增片段 110 bp。MSP反应在Icycler梯度仪(伯乐公司)进行，25μL反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL、2.5 mmol/L三磷酸脱氧核苷酸(d NTP)2.0μL、10 pmol/μL 引物 0.5μL、1 u热启动 Taq DNA酶(Takara公司，日本)、重亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA 80 ng。反应条件为95℃预变性5 min，94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s共 40个循环，72℃延伸 7 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳成像分析(Gene Genius凝胶成像仪，Syngene公司，英国)。

表1 RQ-MSP检测不同浓度PRAME基因与ALU基因质粒结果

1.3.2 阳性模板制备 将1例AML患者的MSP扩增产物经T 4DNA连接酶(Promega公司)克隆入 PGEM-T载体，扩增纯化重组载体、测序鉴定(上海基康)，并将其定量，最后从5×107copy/μL开始进行10倍稀释，建立阳性模板梯度，4℃储存备用。

1.3.3 RQ-MSP PRAM E基因与ALU基因反应程序和反应条件相同。25μL反应体系包含DNA80 ng、10×缓冲液2.5 μL、dNTP(10 mmol/L)0.5 μL 、Mg Cl2(25 mmol/L)2.0 μL、10 pmol/μL引物 2.0μL(ALU 引物为 1.0μL)、20×EvaGreen(BIOTIUM 公司)1.2μL、50×ROX0.5μL、Taq酶1.0 u(MBI公司)。PC R反应在 PE7300(美国ABI公司)扩增仪上进行。反应条件为预变性95℃5 min，95℃ 30 s、62℃30 s、72℃30 s扩增40循环;扩增产物熔解曲线分析程序为 95℃15 s、40℃60 s、90℃ 15 s、60℃15 s。应用参照基因 ALU计算PRAME基因启动子未甲基化水平的相对量，计算公式如下:NP RAME=(EPRAME)△C TP RAME(对照标本)/(EALU)△C TALU(对照标本)，其中E为PCR扩增效率(E=10-1/slope)，△CT为对照样本与待测标本中PRAM E或 ALU基因扩增的循环阈值(CT值)的差异;对照选自PRAME与ALU基因的CT值差异最小的1例正常献髓者。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行统计学数据分析，组间比较应用Mann-Whitney U检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RQ-MSP特异性 RQ-MSP扩增产物的熔解曲线分析揭示不同浓度的PRAME未甲基化阳性模板扩增产物均为单一峰，其Tm值为82.6℃，而PRAM E基因甲基化阳性模板、未经重亚硫酸氢盐修饰的正常基因组DNA和去离子水则未显示峰;并且凝胶电泳结果显示未甲基化阳性模板扩增产物可见一约170 bp左右条带，而甲基化阳性模板和去离子水扩增结果为阴性(图1)。

图1 PRAME基因RQ-MSP扩增产物凝胶电泳

图2 PRAME质粒RQ-MSP标准曲线

2.2 RQ-MSP灵敏度、重复性和扩增效率 对不同浓度PRAM E未甲基化 DNA质粒和ALU质粒分别扩增8次，PRAM E质粒最大灵敏度达 50 copy/μL，重复性不好，5×107～5×102copy/μL重复性良好，见表1。变异系数(CV)为0.59%～1.53%。分别于第1、2、3周扩增PRAME质粒评价其不同时间的重复性，CV值为0.66%～3.35%，见表2。5×107～5×102copy/μL的 PRAM E质粒荧光扩增曲线，其标准曲线的斜率为-3.39，相关系数为0.998，PCR扩增效率(E)为1.97。

2.3 RQ-MSP检测AML组PRAM E基因未甲基化水平 对照组检测发现PRAME基因启动子未甲基化水平较低，见表3。而AM L组中，PRAME基因启动子未甲基化含量则明显增高，两组间PRAME基因启动子未甲基化含量差异有统计学意义(P=0.002)。

表2 不同时间RQ-MSP检测PRAM E质粒的结果

表3 标本中PRAME基因RQ-MSP检测结果[中位(范围)]

3 讨 论

PRAME基因在AM L患者中呈高水平表达，可能通过维甲酸信号通路参与调节细胞增殖[5]、分化和凋亡，其表达量与DNA甲基化程度之间存在可逆关系，提示DNA低甲基化在PRAME基因表达中起着重要的调控作用[6]，检测PRAM E基因低甲基化有助于疾病早期诊断，并为化疗提供预测指标。

基因组DNA甲基化包括高甲基化和低甲基化，目前标准MSP法广泛应用于检测基因组DNA甲基化，它避免了限制性核酸内切酶酶切技术操作复杂、技术难度大、酶切不彻底、不能反映整个CpG岛的甲基化状态等缺点，但是只能定性检测有无甲基化的存在，无法进行定量分析。实时荧光定量PCR建立与目的片段一样的标准品，保证目的片段与标准品的扩增效率一致，减小实验误差[7]，具有快速准确、敏感度高、重复性好和无需PCR后处理等优点，已被广泛应用于核酸定量研究。Toyooka等[8]建立的RQ-MSP法克服了 MSP的缺点，能定量检测目的基因甲基化量，在此基础上，本研究建立了以EvaGreen为荧光染料的RQ-MSP检测PRAME基因未甲基化技术，结果显示 RQ-MS P具有良好的重复性、特异性和灵敏性。

本研究初步检测两组PRAM E基因启动子低甲基化含量，结果表明两者差异有统计学意义，AM L组PRAM E基因启动子区低甲基化水平明显高于对照组，文献报道[9-11]，30%～64%AML患者存在PRAME基因高水平表达，提示AML患者PRAM E基因低甲基化改变可能与其发病相关。

本研究揭示RQ-MSP能够准确检测PRAME基因启动子区的低甲基化水平，并且可用于肿瘤患者初诊标本和化疗后随访标本的M RD检测。

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