杨胜，苏柘僮，杨明

豆腐渣果为山龙眼科山龙眼属（Helicia）植物深绿山龙眼（Helicia nilagirica Bedd）的种子，其有效成分豆腐果苷（Helicid，对苯甲醛-O-β-D-阿洛吡喃糖苷）的化学结构类似于天麻苷（Gastrodin，对羟甲基苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）[1]。药理研究表明，豆腐果苷对中枢神经系统的作用与天麻苷相似，但其镇静止痛作用较天麻苷强，对神经官能症引起的头痛、头昏、睡眠障碍的治疗作用显效快[2]。因此，豆腐渣果在神经官能症治疗方面具有广阔的应用前景。目前已有以豆腐果苷为主要原料的市售品种豆腐果苷片，用于缓解神经官能症引起的头痛、头昏及睡眠障碍，辅助治疗原发性头痛[3]。虽然目前关于豆腐渣果化学成分、药理作用方面的研究报道较多，但是关于豆腐渣果含量测定方法的研究报道却较少。鉴于此，本文拟建立 HPLC 测定豆腐渣果中豆腐果苷含量的方法，为豆腐渣果的进一步应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 豆腐渣果购自成都市荷花池药材市场；豆腐果苷标准品（批号：100385-200401）购自中国药品生物制品检定所；色谱纯乙腈购自美国 Fisher 公司；重蒸水为成都中医药大学炮制与制剂教研室自制；微孔滤头（0.45 μm）购自美国 Millipore 公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器 HPLC 仪（LC-10ATvp 输液泵、SPD-10Avp紫外检测器、CT-10ASvp 柱温箱）为日本岛津公司产品；N2000 HPLC 工作站为浙江大学智达信息工程有限公司产品；BP211D 型电子分析天平为德国 Sartorius 公司产品；KQ-400DB 数控超声波清洗器为昆山市超声仪器有限公司产品；SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器为上海亚荣生化仪器厂产品；DZF-1B 真空干燥箱为上海跃进医疗器械厂产品。

1.2 方法

1.2.1 标准品溶液制备和色谱条件 取豆腐果苷标准品适量，精密称定 4.70 mg，置 250 ml 量瓶中，加水约 250 ml，超声处理 5 min 后取出，放冷至室温，加水至刻度，摇匀即获得浓度为 18.8 μg/ml 的标准品溶液。对标准品溶液进行全波长扫描，扫描范围 200～700 nm，结果显示在 270 nm处有最大吸收，因此采用 270 nm 作为实验检测波长。

参照文献[4]以及预试结果确定色谱条件：色谱柱为菲罗门 Luna-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水-冰醋酸（8∶91∶1），流速 1.0 ml/min，柱温室温，进样量为 5～10 µl。

1.2.2 HPLC 系统适用性检测 以上述色谱条件，分别对豆腐果苷样品溶液和标准品溶液（浓度为 18.8 μg/ml）进行理论塔板数、分离度、拖尾因子实验，各平行实验 5 次。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 样品溶液制备

⑴提取方法与溶媒种类：参照文献[4]以及预试结果，以水为溶媒，采用超声提取方法。

⑵提取时间的考察：取豆腐渣果 100 mg，加入 100 ml水，分别超声提取 30、45、60 min 制备样品溶液。

以上述色谱条件分别对提取时间 30、45、60 min 三个水平进行考察，各平行实验 3 次。

⑶取样量的考察：分别取豆腐渣果 60、80、100 mg，加入 100 ml 水，超声提取 30 min 制备样品溶液。

以上述色谱条件分别对取样量 60、80、100 mg 三个水平进行考察，各平行实验 3 次。

1.2.3.2 专属性考察 分别配制空白溶液、对照品溶液、样品溶液，以上述色谱条件进行实验。

1.2.3.3 线性与范围考察 取浓度为 18.8 μg/ml 的标准品溶液，以上述色谱条件进样测定。以进样量（μg）为 X，峰面积（mV·min）为 Y，做线性回归。

1.2.3.4 精密度考察 取同一豆腐渣果样品 6 份，各约100 mg，分别加入 100 ml 水，超声提取 30 min 制备样品溶液。按照上述色谱条件，平行测定 6 次。

1.2.3.5 稳定性考察 分别取样品溶液和标准品溶液（浓度为 18.8 μg/ml），按照上述色谱条件，对稳定性进行考察。

1.2.4 样品含量测定 取 6 份豆腐渣果样品，各约100 mg，精密称定后置于 100 ml 量瓶中，加水约 100 ml，超声处理 30 min，放冷至室温，加水至刻度，摇匀后滤过（0.45 μm），制备样品溶液，根据上述色谱条件，分别测定样品中豆腐果苷含量。

2 结果

2.1 HPLC 系统适用性

结果理论塔板数按豆腐果苷计算平均为 12003，故确定理论塔板数按豆腐果苷计算不应低于 8000；分离情况良好，故确定分离度不应低于 1.5；拖尾因子平均为 1.01，表明峰型良好；HPLC 仪重复性指标相对标准偏差（RSD）为1.30%，表明仪器重复性良好。

2.2 方法学考察

2.2.1 样品溶液制备 通过对提取时间和取样量的考察，确定提取时间为 30 min，取样量为 100 mg（表 1、表 2）。样品溶液配制方法为：取适量样品细粉约 100 mg，精密称定，置 100 ml 量瓶中，加水约 100 ml，超声处理 30 min 后取出，放冷至室温，加水至刻度，摇匀，滤过（0.45 μm）后取续滤液，即获得样品溶液。

表1 样品溶液制备的提取时间考察（，n = 3）

表1 样品溶液制备的提取时间考察（，n = 3）

时间（min） 豆腐果苷含量（%）30 1.81 ± 0.0345 1.76 ± 0.0460 1.83 ± 0.08

2.2.2 专属性考察 HPLC 分析显示各成分和溶剂之间无干扰，表明该方法专属性良好（图 1）。

表2 样品溶液制备的取样量考察（，n = 3）

表2 样品溶液制备的取样量考察（，n = 3）

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表3 HPLC 测定豆腐果苷的线性与范围考察结果

图1 HPLC 测定豆腐果苷的专属性考察（A：空白溶液；B：对照品；C：样品）

表4 HPLC 法测定样品中豆腐果苷的加样回收率（n = 3）

2.2.3 线性与范围考察 结果表明豆腐果苷在 0.047～0.282 μg 范围内线性关系良好（r = 0.9997），回归方程为：Y = 3 × 106X + 9245.3（表 3）。

2.2.4 精密度与稳定性考察 精密度结果显示 RSD 为3.23%，表明该方法精密性较好。稳定性结果显示样品溶液和标准品溶液的 RSD 分别为 1.04%、1.30%，表明样品溶液和标准品溶液在 12 h 内稳定性良好。

2.2.5 回收率考察 结果显示样品的加样回收率在94.63%～103.59% 之间，RSD为 3.09%（表 4），表明该方法准确度良好。

2.3 样品含量测定

采用 HPLC 方法测定 6 份豆腐渣果样品中豆腐果苷含量，结果显示样品中豆腐果苷含量范围为 1.68%～1.84%，平均含量为 1.75%（表 5）。

表5 豆腐渣果样品中豆腐果苷含量的HPLC 法检测结果

3 讨论

豆腐渣果为云南民间药材，历代本草未见记载。豆腐渣果中可能含有与豆腐果苷结构相似的物质，结合含量测定中样品峰只有一个单峰的现象，考虑到可能该单峰由豆腐果苷与其结构相似的物质所产生，其色谱行为相似，较难分离，且出峰时间重合，因此需要对该单峰的纯度进行检验以鉴别该峰是否仅为豆腐果苷单峰，而不含有其他杂质。

为此，照上述的含量测定方法，我们制备了两份样品以及一份对照品，采用安捷伦 1200 二极管阵列检测器对三个供试品的峰纯度进行检验。结果显示，通过峰纯度检验判别该峰与对照品纯度相似为较纯物质。这一探索性研究结果保证了本含量测定方法的科学性。

综上，本研究结果显示建立的 HPLC 方法精密度高，重复性及线性关系良好，回收率满意，方法科学、合理、可行，符合简便、快速、准确的要求，为豆腐渣果药材含量测定方法提供了参考，为豆腐渣果提取工艺研究奠定了基础，也为豆腐渣果的应用研究提供了有力支持。

[1]Zhao JP, Pan WE, Chen WX.Studied on the chemical constituents of helicia pyrrhoeotrya.Nat Product Res Dev, 1992, 4(4):35-40.(in Chinese)赵劲萍, 潘维恩, 陈维新.焰序山龙眼植物化学成分的研究.天然产物研究与开发, 1992, 4(4):35-40.

[2]Jia MY, Yang YH, Liu JY, et al.The research progress of Helicia nilagirica Bedd.J Traditional Chin Vet Med, 2007, (2):27-29.(in Chinese)贾美艳, 杨永红, 刘君英, 等.豆腐果的研究进展.中兽医医药杂志, 2007, (2):27-29.

[3]Zhao JG, Luo RF.Extraction process for helicid from helicid nilagirica beed.Chin J Pharm, 1991, 22(11):485- 486.(in Chinese)赵建国, 罗瑞芳.豆腐果甙提取工艺改进.中国医药工业杂志,1991, 22(11):485-486.

[4]Liu QF, Ye L, Luo GA, et al.HPLC determination of helicidum in helicidum tablets.Chin J Pharm Anal, 26(10):1392-1394.(in Chinese)刘清飞, 叶磊, 罗国安, 等.HPLC法测定豆腐果苷片中豆腐果苷的含量.药物分析杂志, 2006, 26(10):1392-1394.