【作者】刘成虎，吴平，施燕平

山东省医疗器械产品质量监督检验中心，济南，250101

随着越来越多与血液接触的医疗器械在临床上的使用，大量用于制造该类医疗器械的固体生物材料被不断地开发和应用，并取得了良好的临床使用效果。与此同时，人们对这些生物材料的血液相容性的重视程度也在不断地提高。我们知道，补体是存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组不耐热的、经活化后具有酶活性的蛋白质，补体激活是宿主的一种重要防御机制[1,2]。然而，固体生物材料及相应血液接触类医疗器械激活补体也可能对宿主产生损害或导致医疗器械使用的失效[3,4]，如补体活化释放的C3a和C5a进入血液可导致血管扩张、中性粒细胞聚集及过敏反应；又如C3b可吸附于生物材料的表面，促进血小板活化因子的释放，引起血小板聚集，导致血栓形成。而且，激活的血小板又能通过经典途径激活补体系统，从而使血栓形成的趋势加剧[5]。另外一些固体生物材料中的外源性蛋白，则可诱导产生与人类蛋白交叉反应的IgG或IgM抗体，通过激活补体系统导致组织损伤。因此，本文就固体生物材料对血清补体的激活作用机制以及相关国际标准的最新要求进行介绍，有助于我们更好地开发和使用固体生物材料及相应血液接触类医疗器械。

1 固体生物材料补体激活的途径

固体生物材料与血液接触以后，可以通过以下两条途径激活机体的补体系统（见图1）。一是经典途径的补体激活，即固体生物材料与血浆中的免疫球蛋白形成抗原-抗体复合物，依次激活C1、C4、C2，形成C3转化酶（C4b2b）；后者可活化C3，并形成C5转化酶（C4b2b3b）；C5转化酶可活化C5，并依次结合C6～C9,最终形成膜攻击复合物（MAC），从而发挥补体的生物学作用。如使用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）就可发生这种途径的补体激活。二是固体生物材料表面的侧链基团，如羧基、氨基等可与C3分子的磺酸酯基团共价结合，并为补体激活提供接触表面，在血液中的B因子和D因子的作用下，形成C3转化酶（C3bBb）；后者可活化C3并形成C5转化酶（C3bBb3b），最终也形成MAC。如使用硫酸纤维素可发生补体的旁路途径激活。同时，因为不需要抗体参与，所以旁路途径补体激活的时间要早于经典途径补体激活的时间。

2 国际标准中对与循环血液接触器械适用补体试验的新要求

图1 固体生物材料的补体激活途径Fig.1 Complement activation approach by solid biomaterial

我们知道，血液接触类医疗器械临床使用风险一般比较高，所以市场准入门槛也就比较高。我国将其归为第三类医疗器械，即植入人体，用于支持、维持生命，对人体具有潜在危险，对其安全性、有效性必须严格控制的医疗器械。并且，该类器械产品的注册技术审评工作，一律由国家医疗器械技术审评机构执行。不仅我国如此，美国、欧盟、日本等国对该类医疗器械安全性控制也非常严格。相关的国际标准要求也在不断地更新。ISO 10993系列标准中医疗器械生物学评价 第4部分：与血液相互作用试验选择（GB/T 16886.4）在2006年发布该部分标准的修改单[ISO 10993-4:2002/Amd.1:2006(E)][6]在修改单中增加了适用补体试验的与循环血液接触器械的种类，并将其与溶血、血栓形成、凝血一起列为血液接触类医疗器械血液相容性评价的重要指标，进一步强调了该试验在医疗器械血液相容性评价中的重要地位（见表1，表2）。

表1 与循环血液接触器械部件（外部接入器械）Tab.1 Circular blood Contacting medical devies(extrinsic)

表2 与循环血液接触器械部件（植入器械）Tab.2 Circular blood Contacting medical devies(embedded)

从表1和表2中可以看出，新版国际标准对与血液接触时间较长和接触程度较高的器械，基本上都列入了补体激活试验的要求，这符合该类医疗器械生物安全性评价的发展趋势。虽然ISO 10993系列标准的本部分适用于成品医疗器械，但这同时也彰显出对固体生物材料及相应血液接触类医疗器械补体激活作用研究的重要性。

3 如何选用固体生物材料补体激活作用的标准

目前，国际上还没有统一、认可的检测固体生物材料及相应医疗器械补体激活作用的实验方法学标准。虽然国内外实验室中用于固体生物材料补体激活作用检测的方法很多，但大多只限于从补体活性片段数量的角度来分析，没有涉及到补体的功能检测，并且实验成本一般比较高，同时在可靠性、重现性和预示临床性能方面尚存缺陷。因此，有必要对补体激活试验标准及如何选用这些标准进行介绍，为固体生物材料补体激活作用的检测提供新的思路。

3.1 通过补体关键分子数量来检测补体激活作用

固体生物材料及相应的医疗器械与血液接触后，如激活补体，首先表现出来的是血清补体关键分子的改变，如C3数量的减少，GB/T 14233.2-2005中提供了相应补体分子的检测方法。该标准通过与对照组相比，体外检测血清补体活化期间所形成C3a的量来判定医疗器械对人血清补体激活情况，从而推断医疗器械的补体激活潜能[7]。其它可用于检测的补体分子还包括C5a、Bb和C4d等。目前，人们已经开发出各种商品化的试剂盒，来针对这些补体分子的检测，因此操作十分方便，且适用于多种固体生物材料和相应医疗器械补体激活潜能的检测。但如果想深入了解固体生物材料的补体激活作用，还需进一步分析补体的功能。

3.2 通过血清总补体功能变化来检测补体激活作用

3.2.1 CH50

血清总补体功能活性的改变，可直观地反映固体生物材料及相应医疗器械的补体激活作用。因此，总补体功能活性的检测可用作补体激活试验的常规筛选试验。CH50是测定血清总补体活性的最简单的方法，它的降低可表明血清总补体的消耗[8]。虽然实验室常通过观察CH50的改变来判定血清总补体的活性，但该项试验的特异性不高，且易受环境和操作者的影响，因此一般不推荐将其用于固体生物材料补体激活作用的筛选。

3.2.2 ASTM F 1984-99

美国材料协会于1999年发布了一个简单、廉价的用于测定固体生物材料对血清总补体的功能性体外激活作用的技术规范，即ASTM F 1984-99[9]。该规范主要包括两个步骤：步骤A中将固体材料与标准数量的人血清接触；步骤B中通过检测补体介导的绵羊红细胞裂解情况，测定接触血清内总补体的显著功能性缺失。

ASTM F 1984-99可用于多种生物材料补体激活作用的检验，如醋酸纤维素、乳胶等。该规范虽然从功能上检验了固体生物材料补体激活的情况，但是在激活机制上不能区分是经典途径激活还是旁路途径激活。事实上，微量激活物仍可能产生足量的裂解产物（C3a、C5a等），产生局部炎症反应，但却不会引发总补体活性的显著改变。所以，该规范推荐的检测方法对微弱补体激活物的敏感性不足，不适用于一些弱补体激活作用的固体生物材料，故需将获得的结果与其它的试验结果结合考虑，如旁路途径的补体激活，共同评定试验材料的补体激活特性。

3.3 其他补体激活试验的选择

3.3.1 ASTM F2065-00

固体生物材料及相应器械与血液接触后，最先被激活的补体通路为旁路途径。因此，旁路途径激活对植入器械或外部接入血液器械用固体生物材料的筛选有重要意义。ASTM F2065-00就是一种评价固体生物材料旁路途径补体激活潜能的方法[10]。该规范的步骤A是将固体生物材料与标准量的C4缺失的豚鼠血清[C4（-）GPS]接触；步骤B则是通过检测补体介导的兔红细胞裂解情况，来分析接触血清中功能性补体的活性。

C4（-）GPS不支持经典途径补体激活，因此ASTM F2065-00是固体生物材料旁路途径补体激活的特异性试验，特异性和敏感性都优于总补体活性的检测，故适用于筛选多种固体生物材料及相应医疗器械的补体激活特性。但与此同时，ASTM F2065-00中未涉及补体激活后具体效应分子的免疫功能，因此它也不是评价所有固体生物材料补体激活潜能最敏感和最特异的方法。如需要对单个补体裂解产物（如Bb和C4d等）进行免疫分析，还宜考虑生物材料对补体蛋白的非特异性吸附或通路激活[11]。

3.3.2 体内补体激活试验

除了体外补体激活试验，过去人们还常用免疫化学法来定量分析体内补体激活所产生的补体片段，进而评定补体激活作用。最近，Martin[12]等还应用特异性单克隆抗体法来研究体内补体激活时所产生的补体片段，并取得了较好的结果。但是，鉴于血浆补体分子的多样性，且这些补体分子在体内条件下又会被迅速代谢，更增加了体内补体激活试验的复杂性。因此，目前还不推荐将其用于固体生物材料及相应医疗器械补体激活潜能的检测。

4 结语与展望

多年来，血清补体激活作用一直是固体生物材料血液相容性研究的热点领域。国际标准ISO 10993-4中也将补体活性产物的检测，列入评价血液接触类医疗器械血液相容性的一部分。然而，目前人们对固体生物材料的补体激活作用的认识还有许多不足之处，具体表现在：（1）目前用于检测固体生物材料补体激活的方法众多，且不统一，因此缺乏相应的行业标准来规范该项要求；（2）因为现有的ISO 10993系列标准对某些生物可降解材料、纳米材料以及组织工程产品评价的不适用性，对这些材料的补体激活作用研究乃至血液相容性的评价将如何进行？（3）补体激活一般为急性期反应，但是慢性局部补体激活对医疗器械正常功能发挥的影响及具体机制还不明确；（4）其他形态的生物材料及相关器械中的添加剂、加工助剂等对补体的激活机制是什么？如Lamba 等[13]在体外研究医用聚氯乙烯（PVC）对接触血液影响时就发现，PVC中溶出的增塑剂DEHP是一种较强的补体激活剂，可激活补体产生C3a。虽然以上问题还有待进一步的研究和确认，但是我们有理由相信，随着生物材料和分子生物学的不断发展，对生物材料的补体激活机制的研究将会日趋成熟。

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[6]GB/T 16886.4 医疗器械生物学评价 第4部分：与血液相互作用试验选择（ISO 10993-4:2002，IDT）

[7]GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分 生物试验方法

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