（福建农林大学蜂学学院，福州 350002）

蜂胶可作为天然的抗氧化剂[1]，由于从不同产地、不同胶源植物采集的蜂胶成分有差异，从而导致不同来源的蜂胶抗氧化清除自由基能力也有差异。总黄酮含量、醇溶物含量是蜂胶质量标准中必测的重要理化指标，探讨蜂胶抗氧化清除自由基能力与两者之间的相关性，为是否可能在测定了蜂胶总黄酮含量或醇溶物含量的同时，还可以快速地判断来源不同的蜂胶抗氧化清除自由基能力的强弱提供依据。

1 材料与方法

1.1 蜂胶

原始蜂胶样品共16个，分别来自辽宁喀左县紫金蜂业科技公司、辽宁丹东、北京蜂业公司、北京天宝康高新技术开发有限公司、青海民和县、陕西宝鸡、四川成都、河南长兴蜂业有限公司、河南新乡、山西榆次晋中总蜂场、山东蒙阴县蒙山蜂人蜂业有限公司、湖北随州鸿发蜂产品有限公司、湖北随州、杭州浙江大学动物科学学院、上海康亨园蜂业有限公司、福州福建农林大学蜂学学院意蜂场。

1.2 仪器

752紫外可见分光光度计、KQ－300VDE型双频数控超声波清洗器、多联过滤器、DZF－6050真空电热恒温干燥箱、BS224S电子天平、FW100高速万能粉碎机、碘量瓶、容量瓶、漏斗、移液枪、试管、烧杯等实验室常规玻璃器皿。

1.3 试剂和溶液

0.2 mol·L－1磷酸缓冲液（pH7.4）、0.75 mmol·L－1邻二氮菲无水乙醇溶液（现用现配）、0.75 mmol·L－1硫酸亚铁溶液（现用现配）、0.01%过氧化氢溶液（现用现配）、100 g·L-1硝酸铝溶液、9.8 g·L-1醋酸钾溶液、95%乙醇、无水乙醇（以上试剂均为AR级）。

Tris-HCl缓冲溶液：称取三（羟甲基）氨基甲烷1.211 g，用水溶解定容至100 mL，得0.1 mol·mL-1Tris溶液；量取 36%－38%HCl 0.429 mL，用水稀释定容至100 mL,得0.05 mol/L HCl溶液，稀释5倍得10 mmol·L-1HCl溶液；50 mL 0.1 mol/L Tris 溶液和45 mL 0.05 mol/L HCl溶液混匀，用0.05 mol·L-1HCl溶液调至pH值为8.2。

邻苯三酚溶液:称取0.0378g邻苯三酚，用10mmol·L-1HCl溶解，定容至 100mL, 得 3mmol·L-1邻苯三酚溶液。

芦丁标准溶液：精确称取经120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，无水乙醇溶解、移入50 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，准确移取10 mL，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀。

1.4 蜂胶乙醇提取液的制备

蜂胶样品经冷冻，高速万能粉碎机粉碎，过80目筛后，准确称取2g左右与95%乙醇按1：10（W/V）混和于碘量瓶中，摇匀，置于超声波发生器内超声提取[2]（超声频率45KHz、时间30min），取出后抽滤，分别收集滤液、滤渣，滤液再用中速滤纸过滤，得到澄清滤液，用95%乙醇稀释滤液、定容，即为蜂胶乙醇提取液（简称蜂胶醇提液）。

1.5 蜂胶醇提液对羟自由基（·OH-）清除率的测定

试验步骤：参照同类方法[4]，取1mL0.75mmol·L-1邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入2mL 0.2 mol·L-1的磷酸缓冲液 (pH=7.4)和0.2mL蒸馏水，充分混匀，加入 1mL 新配制的 0．75 mmol·L-1硫酸亚铁溶液，混匀后加入1mL新配制的0.01%的过氧化氢溶液，于37℃水浴加热60min后，在536nm测吸光值，所测得的吸光值为损伤管的吸光值。未损伤管以1mL蒸馏水代替损伤管中过氧化氢溶液，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光值。蜂胶醇提液0.05mL代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536 nm样品管的吸光值。

1.6 蜂胶醇提液对超氧阴离子自由基(·O2-)清除率的测定[5]

试验步骤：（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：移取 4.5mL 50mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液（pH8.2）、4.2mL蒸馏水于25mL的试管中混匀后，37℃水浴中保温20 min，取出后立即加入0.5mL 37℃预热过3 mmol·L-1邻苯三酚，迅速摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30s测定吸光值，计算线性范围内每分钟内吸光值的增加。以10mmol·L-1HCl溶液作空白管为对照，记录结果。（2）加入蜂胶醇提液后邻苯三酚自氧化速率的测定：按照上述步骤在加入邻苯三酚前先加入0.5mL蜂胶醇提液，蒸馏水相应减少。同样以10mmol·L-1HCl溶液作空白管为对照，测定吸光值。

式中：△A1/△t为邻苯三酚自氧化时反应速率；△A2/△t为加入蜂胶醇提液后邻苯三酚自氧化时反应速率。

1.7 蜂胶醇提液总黄酮含量的测定[6]

试验步骤：将芦丁配制成标准溶液，测定其吸光值，绘制标准曲线。用蜂胶醇提液1mL替换芦丁标准溶液，测定其吸光值。根据标准曲线的回归方程，计算出蜂胶醇提液中总黄酮的含量。

1.8 蜂胶醇提液醇溶物含量的测定

合并上述1.4中的滤渣，置真空电热恒温干燥箱内干燥至恒重，准确称量。

结果计算：蜂胶醇溶物含量（mg·mL-1）=（原胶重-滤渣重）÷定容后滤液mL数

1.9 数据的处理

用统计软件SPSS 15.0进行数据的处理。

2 结果与分析

2.1 蜂胶醇提液对羟自由基(·OH-)的清除率

用上述1.5的方法测定蜂胶醇提液对·OH-清除率的结果：16个样品中清除率最低的为4.274%，最高的为67.52%，显示不同来源的蜂胶醇提液对羟自由基都有一定的清除能力，但清除能力存在明显的差异。这种差异主要来自于来源不同的样品中清除·OH－的具体成分及其浓度的差异，详见表1。

表1 蜂胶醇提液对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率及其总黄酮含量和醇溶物含量

2.2 蜂胶醇提液对超氧阴离子自由基(·O2-)的清除率

用上述1.6的方法测定蜂胶醇提液对·O2－清除率的结果，16个样品中清除率最低的为4.10%，最高的为26.95%，显示不同来源的蜂胶醇提液对·O2－都有一定的清除能力，但清除能力存在明显的差异，与清除羟自由基的能力对比，这种差异较小，详见表1。

2.3 蜂胶醇提液总黄酮含量的测定

用上述1.7的方法测定了蜂胶总黄酮的含量，结果显示来自不同地区蜂胶中的总黄酮含量差异明显，最低的为 0.190 mg·mL－1,最高的为 0.454 mg·mL－1，这主要与样品中醇溶物的含量关系密切，因为黄酮类化合物易溶于乙醇，详见表1。

2.4 蜂胶醇提液醇溶物含量的测定

用上述1.8的方法测定了蜂胶醇溶物的含量，结果显示来自不同地区蜂胶中的醇溶物含量差异明显，最低的为 34.71mg·mL－1，最高的为 174.79mg·mL－1，这主要与蜂胶中杂质含量少或多关系密切，而蜂胶的杂质含量往往取决于采胶的方式，并且还与不同地区胶源植物种类的不同有关，详见表1。

2.5 蜂胶醇提液对羟自由基的清除率与其总黄酮含量、醇溶物含量相关性分析

数据经统计软件SPSS 15.0分析显示，蜂胶醇提液对羟自由基的清除率与其总黄酮含量之间存在着极显著的正相关关系（r＝0.751，P＝0.001＜0.01），与其醇溶物含量之间也存在着极显著的正相关关系（r＝0.650，P＝0.006＜0.01）；表明醇溶物中的黄酮类化合物是蜂胶醇提液清除羟自由基的主要功效成分。

2.6 蜂胶醇提液对超氧阴离子自由基的清除率与其总黄酮含量、醇溶物含量相关性分析

数据经统计软件SPSS 15.0分析显示，蜂胶醇提液对超氧阴离子自由基的清除率与其总黄酮含量之间几乎不存在相关关系（r＝0.414，P＝0.11＞0.05）；与其醇溶物含量之间也不存在明显相关关系（r＝0.119，P＝0.66＞0.05）；表明蜂胶醇提液对超氧阴离子自由基的清除能力不由其中的总黄酮含量或醇溶物含量的高低所决定，还有其他的功效成分。

3 讨论

试验结果显示，蜂胶醇提液清除自由基能力与总黄酮含量、醇溶物含量的相关性表现不一致。如清除羟自由基能力与总黄酮的含量、醇溶物的含量存在着极显著的正相关关系，而清除超氧阴离子自由基能力却与总黄酮含量、醇溶物含量几乎不存在相关关系，相当于在已知不同来源蜂胶醇提液的总黄酮含量或醇溶物的含量后，可以判断它们清除羟自由基能力的强弱；但仍无法判断它们清除超氧阴离子自由基的能力。

沈海涛(2002)研究蜂胶在清除氧自由基试验中发现，氧自由基的清除能力与总黄酮、总酚无对应关系[7]。陈明之（2007）研究的结果，蜂胶95%乙醇提取液清除羟自由基的能力与总黄酮含量呈正相关[8]。

蜂胶的成分复杂，这很可能是其清除自由基能力与总黄酮含量、醇溶物含量相关性表现不一致的原因。有人在北温带地区的蜂胶中鉴定出305个化合物，其中黄酮类化合物71个，芳香酸与芳香酸酯59个，氨基酸25个，醛与酮类化合物17个，脂肪酸与脂肪酸酯50个，萜类化合物19个，甾体化合物6个，糖类化合物9个，烃类化合物25个，醇、酚类和其他化合物24个[9]。

本试验结果显示清除羟自由基是黄酮类化合物在起主导作用，清除氧自由基不是黄酮类化合物而是蜂胶中的其它成分在起主要的作用，具体是那些成分、何种物质，怎样发挥作用的还有待进一步的研究。

[1]唐传核,孟岳成.蜂胶的生理功能以及开发研究 [J].食品工业科技,1999，（2）：30－32.

[2]叶静凌，刘富海，乞永艳等.超声技术在蜂胶提取上的应用研究[J].蜜蜂杂志(月刊)，2008，（5）：7－9.

[3]金鸣,蔡亚欣,李金荣等.邻二氮菲－Fe～（2＋） 氧化法检测H_2O_2／Fe～（2＋）产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理进展,1996,(6):553－555.

[4]徐颖，方金凤，顾岚.蜂胶黄酮清除自由基作用的研究[J].食品工业,2008,(1):23－25.

[5]玄红专,桑青,麻建军.邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究[J].食品科技,2008,(4):137－139.

[6]GB/T20574－2006:蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法.

[7]华启云，李英华，胡福良.蜂胶抗氧化作用的研究进展[J].养蜂科技 2OO4，（5）：4－5.

[8]陈明之.蜂胶抗氧化作用研究[J].食品研究与开发，2007，Vol.28（.11）：40－41.

[9]郭伽，周立东. 蜂胶的化学成分研究进展[J].中国养蜂，2000，Vol.51（2）：17－18.