曲恒怡

p53正向凋亡调控因子（PUMA）是p53下游的细胞凋亡促进因子[1,2]。最近研究提示，胰腺癌组织中PUMA表达缺失，PUMA表达缺失组织存在细胞凋亡的阻滞[3]，而增加细胞内PUMA表达后，体外胰腺癌细胞的生长明显被抑制[4]。因此，诱导或恢复细胞内PUMA蛋白表达可能是胰腺癌治疗的重要方法。

许多化疗药物的抗肿瘤作用是通过促进细胞凋亡实现的。吉西他滨是一类较新的抗细胞代谢类药物，该药可明显改善胰腺癌患者症状、延长患者生存期，并已成为进展期胰腺癌的首选治疗药物[5,6]。 吉西他滨的一个作用是促凋亡效用，但其作用机制还不清楚。以前的研究发现，吉西他滨促进体外胰腺癌细胞凋亡的过程中伴随着PUMA表达的明显上调[7]。

本文研究吉西他滨能否对PUMA表达抑制后的胰腺癌细胞产生凋亡促进作用和生长抑制作用，旨在探讨吉西他滨的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

Western blotting和RT-PCR试剂盒购自日本TaBaRa公司；PUMA抗体购于Cell Signaling公司；Hoechst 33258，MTT购自sigma。吉西他滨（生产厂家：ULLY FRANCE S.A，注册证号H20020180）；RPMI1640培养基，小牛血清为Gibico公司产品；TUNEL检测试剂盒，Lipofectamine 2000为北京中山生物公司产品。PcDNA3.1-PUMAAS和pcDNA3.1-真核表达载体由王新颖博士赠送（南方医科大学消化病研究所）；该载体含有592bp PUMA cDNA，酶切位点位于BamH1和Xbal。

1.1.2 细胞株

胰腺癌细胞系AsPC-1购自中科院上海细胞所，细胞用含10%胎牛血清的RPMR1640培养基培养，细胞培养条件为37℃恒温，饱和湿度和5%CO2，指数生长的细胞为实验对象。

1.2 方法

1.2.1 基因转染及稳定表达细胞株的筛选

AsPC-1细胞在含有10%小牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。用0.25%的胰酶消化细胞后，按每孔4×104个细胞均匀加入96孔板中，培养至细胞85%～90%汇合后，分别转染PcDNA3.1-PUMAAS和pcDNA3.1-质粒，具体操作按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行。转染24h后将细胞以1∶10比例传代，次日开始用含有500μg/mLG418的培养基进行筛选培养，每3d更换一次培养基，连续筛选3周，然后将获得的细胞克隆，扩大培养。

1.2.2 MTT测定

收取指数生长期的AsPC-1细胞以及稳定转染PcDNA3.1-PUMAAS和pcDNA3.1-质粒的AsPC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用RPMI1640配成浓度为1×105/mL的细胞悬液，于96孔培养板每孔加100μL，37℃，5%CO2条件下孵育12h后，弃上清，于96孔培养板中分别加无血清164010μL为空白细胞对照。每孔分别加入10μL浓度分别为1、5、10和15μmol/mL吉西他滨，37℃，5%CO2条件下孵育1h后，每孔补加90μL10%1640，随后分别于72h后每孔加MTT（5mg/mL）10μL，继续孵育4h后加入溶解剂[10%SDS+1%HCl（1mol/L）]100μL/孔，于37℃至次日待甲 结晶完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测OD570值。以OD540值为纵坐标，时间（h）为横坐标绘制生长曲线。并按抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值的公式计算细胞生长抑制。实验重复3次，结果用±s表示，同时以非吉西他滨治疗组对照。

1.2.3 流式细胞仪分析早期细胞凋亡率

分别收取吉西他滨处理72h后的实验组和对照组的细胞，用pH 7.4的0.01mol/L PBS洗涤后，体积分数为70%冰乙醇4℃固定24h后，用流式细胞仪检测亚G1 期出现凋亡峰（Ap峰）的细胞凋亡率。

1.2.4 Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡

接种细胞于6孔板中，每孔细胞约5×105，待细胞生长至适当密度时，1×PBS充分冲洗3次后，加入冰预冷的甲醇500μL/L，于冰上放置10min，再以1×PBS充分冲洗至少3次，1μmol/L Hoechst33258室温染色10min，1×PBS充分冲洗3～5次。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核，凋亡小体颜色加深呈深蓝色或形状不规则。

1.2.5 TUNEL检测晚期细胞凋亡

离心重悬各组细胞，调细胞数为1×108cells/L，接种细胞于内置盖玻片的3.5cm培养皿，37℃温箱孵育24h后更换新鲜培养基，继续孵育72h，观察细胞形态、照相，取出盖玻片，采用TUNEL试剂盒，按试剂盒说明书操作，加入荧光素标记的脱氧核苷酸混合工作液，37℃孵育1h后采用493nm的蓝光在荧光显微镜下观察，计算每个高倍视野下凋亡细胞数，每一样本随机计数5个视野。观察完毕继续进行DAB显色，封片。

1.2.6 Western Blot检测蛋白的表达

提取细胞总蛋白进行Western Blot检测：SDS-PAGE分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%，上样量为15μg/L；SDS电泳：恒流，每块板20～40mA，电泳时间约2h；转膜：恒流，每张膜42mA，时间： 3.5h。

1.2.7 RT-PCR 检测

按TRizol试剂盒（Invitrogen公司）说明书操作提取药物作用72h的不同组细胞总RNA，取1μg RNA模按RT试剂盒（Takara公司）说明书反转录得到cDNA。引物序列PUMA：R：5'-AGTCTG GGGAGACATGGGCTGG-3'F：5'-CAGCCATCCAGCACTGCCA TTC-3'（324bp），G3PDH（500bp）R：5'-TCCACCACCCTGT TGCTGTA-3' F：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'反应条件：50℃30min 94℃ 2min，94℃ 30s，55℃ 30s 72℃ 1min，72℃延伸7min，28循环。以上引物由赛百盛公司合成。取5μL 反应产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用SYNGENE型凝胶成像系统照像，以目的基因条带和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量。试验重复3次，数据以±s表示。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 MTT检测

浓度分别为1、5、10和15mmo/L的吉西他滨10μL作用AsPC-1细胞72h后，对照组，pcDNA3.1-和pcDNA3.1-PUMAAS组细胞的生长抑制率见Fig1。吉西他滨抑制对照组，pcDNA3.1-空载体组细胞增殖，而转染pcDNA3.1-PUMAAS后的细胞生长不受影响，说明PUMA表达抑制后抑制吉西他滨引起的细胞生长。

2.2 FCM检测

递增浓度的吉西他滨作用对照组AsPC-1细胞72h后，细胞凋亡率逐渐增加，浓度为1mmol/L时，凋亡率为3.92±1.56，而浓度为15mmol/L时，凋亡率为27.82±1.42，吉西他滨有明显的促凋亡效应，并与浓度有明显的依赖性；pcDNA3.1组细胞凋亡率在浓度为1mmol/L时为4.2±1.46，而浓度为15mmol/L时，凋亡率为25.44±1.37，两组相比差异无显著性（P＞0.05）；pcDNA3.1-PUMAAS组AsPC-1细胞受到1、5、10和15mmo/L的吉西他滨作用后，细胞凋亡率分别为0.72±0.86、0.92±0.73、1.38±0.48、1.73±0.45，与对照组和pcDNA3.1-空载体组比，差异分别有统计学意义（P＜0.01），与正常AsPC-1的凋亡率0.69±0.43比差异无显著性（P＞0.05）说明PUMA表达抑制后抑制吉西他滨引起的细胞凋亡（Fig2）。

2.3 TUNEL检测

吉西他滨作用对照组AsPC-1细胞72h后，玻片均可检测到凋亡细胞，随着浓度的增加，凋亡逐渐明显。这些TUNEL阳性细胞呈现了凋亡的多态性特征，部分凋亡细胞核出现浓缩断裂。15μmol/mL的吉西他滨作用72h后凋亡指数分别为10.74±2.3（Fig3.1A），而pcDNA3.1-PUMAAS组AsPC-1细胞在15μmol/mL的吉西他滨作用72h后，凋亡指数分别为1.2±0.93（Fig3.1B），两组相比相比有显著性差异P＜0.01）（Fig3.2），提示吉西他滨能诱导细胞凋亡，pcDNA3.1-PUMAAS转染抑制吉西他滨引起的细胞凋亡。

Fig3.1 TUNEL analysis for AsPC-1 cells treated by Gemcitabine

2.4 Hoechst33258染色检测细胞凋亡程度

正常细胞核形态正常，而经吉西他滨作用的AsPC-1细胞，用Hoechst 33258染色后显示，细胞皱缩，体积变小，核固缩，核染色质浓缩，凋亡小体，表面起泡（Fig4A），表明吉西他滨能够诱导AsPC-1细胞凋亡，而pcDNA3.1-PUMAAS组AsPC-1细胞在吉西他滨作用下凋亡表现不明显（Fig4B）。

2.5 吉西他滨对PUMA蛋白和PUMAmRNA表达的影响

Fig4 Hoechst staining for AsPC-1 cells treated by Gemcitabine

AsPC-1细胞给于浓度分别为1、5、10和15mmo/L的吉西他滨10μL作用72h后，PUMA蛋白和PUMA mRNA表达逐渐增加，在15mmo/L时表达量达到高峰。当AsPC-1转染pcDNA3.1-PUMAAS 抑制PUMA表达后，吉西他滨诱导PUMA表达的作用消失（Fig5-6）。

3 讨 论

PUMA是新近发现的Bcl-2家族BH-3亚家族中的成员，是p53的主要靶基因，可被内外源野生型p53快速诱导。PUMA通过其下游Bax/Bak及Bcl-2/Bcl-xL相互作用，引起Bax活化、细胞色素C释放及caspase级联效应，导致细胞凋亡[1]。

Nakano等[2]证实转染外源性PUMA基因可诱导细胞的快速凋亡和抑制集落形成，此外，转染外源性PUMA基因还可增强细胞对化疗的敏感性。Reimerta等[8]还发现，PUMA在线粒体应激诱导的凋亡中也是必须的。许多抗癌药物引起肿瘤细胞凋亡与细胞中PUMA活化有关，例如，在给予抗癌药物5-FU、DNA损伤剂多柔比星作用结肠癌细胞后，细胞中PUMA转录本明显增高的同时可快速出现细胞凋亡[1]。

吉西他滨是一种新的类似5-FU的抗代谢类抗癌药物，在临床上应用广泛，特别是在晚期胰腺癌治疗中有着无可替代的重要作用。吉西他滨被细胞摄入后转变为活性代谢物，竞争性抑制DNA链的延长，导致DNA 片段形成和细胞死亡。

我们研究了吉西他滨对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响发现，吉西他滨明显促进细胞凋亡，抑制细胞生长，并呈剂量依赖性。吉西他滨诱导肿瘤细胞凋亡的机制和途径目前尚未完全明了。

在本实验中，我们试图研究了药物作用与基因表达和凋亡的关系，结果发现，PUMA表达随药物浓度的增加而升高，同时伴有细胞凋亡的进行性升高，当PUMA表达抑制后，吉西他滨诱导PUMA的现象消失，细胞凋亡水平也明显下降，细胞生长不受到抑制，说明吉西他滨通过诱导PUMA表达而促进细胞凋亡。

我们的研究提示，PUMA是胰腺癌治疗的新靶点，PUMA基因转染并联合化疗药物可能增强胰腺癌的治疗效果。

[1]Yu J,Zhang L,Hwang PM.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cell[J].Mol Cell,2001,256(7):671-682.

[2]Nakano K,Vousden KH.PUMA,a novel proapoptosis gene is induced by p53[J].Mol .Cell,2001,256(7):683-694.

[3]张克君,李德春,朱东明.PUMA蛋白在胰腺癌中的表达及临床意义[J].世界华人消化杂志,2008,16(5): 488-492.

[4]张克君,李德春,朱新国,等.外源野生型p53正向细胞凋亡调控因子基因对人胰腺癌细胞生长的作用[J].中华消化杂志,2006,26(11):778-779.

[5]Mimeault M. Recent advances on the molecular mechanisms involved in pancreatic cancer progression and therapies[J].Pancreas,2005,31(4):301-316.

[6]Westphal S.Apoptosis: targets in pancreatic cancer[J].Mol Cancer,2003,2:6.

[7]张克君,李德春,赵志莪.PUMA与c-myc在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的表达[J].苏州大学学报(医学版).2007,27(6):356-357.

[8]Reimerta C,Kogel D,Rami A.Gene expression during ER stressinduced apoptosis in neurona: induction of the BH3-only protein Bbc3/PUMA and activation of the mitochondrial apoptosis pathway[J]. J Cell Biol,2003,162(4):587-597.