陈 国，肖雅琴，陈宏文

(华侨大学化工学院，工业生物技术福建省高校重点实验室，福建 厦门 361021)

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)常栖息于人和动物的肠道系统中，对人和动物无害，具有良好的生物相容性。它代谢甘油产生一种特殊的抑菌物质——罗伊氏素(reuterin)，其主要成分是3-羟基丙醛(3-HPA)的单体、水合物和环化二聚体[1]。

罗伊氏素中的主要成分3-HPA单体是一种潜在的重要化工原料，可作为多种新兴化学品如丙烯醛、丙烯酸、1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PD)等的前体，用于制备新型聚合物材料[1]；可和蛋白质中的氨基反应形成交联，有望取代化学合成的戊二醛和环氧化合物作为新型生物交联剂[2-3]；可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌、病原虫、原生动物等的生长[4-6]，正逐步被开发成新型广谱抗菌剂，包括用作生物防腐剂[7-8]、生物灭菌剂[9]、口香糖添加剂[10]和抗感染治疗剂[11]。瑞典BioGaia 公司已经开发了一系列包含L.reuteri的益生菌制剂，在全世界范围内销售，用于改善人和动物的健康水平。我国卫生部也于2003年批准罗伊氏乳杆菌作为保健食品益生菌种。但对其培养基和培养条件的优化简化少见于文献。因此，研究L.reuteri的生长及代谢具有重要意义，将为L.reuteri发酵甘油制备3-HPA提供参考。

响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化工艺条件的有效方法，中心组合设计(CCD)可用于确定实验因素及其交互作用对指标响应值的影响，精确表述因素和响应值之间的关系[12]。本实验先进行单因素试验确定氮源，再用Plackett-Burman设计考察L.reuteriCG001 MRS培养基、pH值及培养温度，筛选出4个关键因素，进一步用CCD设计对关键因素进行响应面优化分析，得到最优培养条件，最终在成本降低的情况下获得更高菌体质量浓度。最优条件下在发酵罐中厌氧培养L.reuteriCG001，测定其基本生长代谢情况。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：罗伊氏乳杆菌(L.reuteriCG001)由工业生物技术福建省高校重点实验室筛选保藏。

MRS培养基：蛋白胨 10g、牛肉膏 10g、酵母浸膏 5g、葡萄糖 20g、磷酸氢二钾 2g、醋酸钠 5g、柠檬酸铵 2g、硫酸镁 0.2g、硫酸锰 0.05g、吐温-80 1g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6。

1.2 方法

1.2.1 MRS培养基的配制及菌种的培养

配制MRS培养基，充氮气并加胶塞和铝盖，灭菌后按体积分数1%接种，37℃静置培养。最优条件下以5%接种量于发酵罐中培养时，以恒定流速充氮气保证其厌氧环境，搅拌转速200r/min，pH5.5。

1.2.2 菌体质量浓度的测定

建立光密度(OD600nm)与干质量浓度(cell dry weight，CDW)的标准曲线，测OD600nm换算菌体质量浓度。

1.2.3 发酵上清液中葡萄糖、乳酸、乙酸和乙醇质量浓度的测定

采用HPLC法：AminexHPX-87H柱，柱温60℃，流动相为5mmol/L硫酸，流速0.6mL/min，示差折光检测器(RID)，手动进样20μL。

1.3 实验设计

以菌体质量浓度为响应指标，采用3步进行优化：首先进行单因素试验确定氮源；其次运用Plackett-Burman设计选出对响应值影响较大的几个因素；然后再采用响应面法中的CCD进行试验，通过实验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优实验条件，并进行验证实验。

1.3.1 菌体生长氮源的选择

原始MRS培养基是富集培养基，其中含蛋白胨、牛肉膏和酵母膏3种氮源，为降低成本并与大豆蛋白胨、玉米浆干粉及酵母粉进行比较，用单因素试验筛选出满足菌体生长的单一氮源。试验中各种氮源的质量浓度保持一致，为10g/L，培养基的其他因素及水平不变。

1.3.2 Plackett-Burman设计对试验因素的筛选

根据单因素试验结果，应用Design Expert软件对MRS培养基及培养条件进行Plackett-Burman设计(表1)。以菌体质量浓度为响应值，对影响菌体生长的10个主要因素进行筛选：即酵母膏、葡萄糖、柠檬酸铵、醋酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰和吐温-80的质量浓度，初始pH值，培养温度，外加一个虚拟变量。每个变量分别确定高(+1)和低(－1)两个水平，共进行12次试验以确定每个因素的影响水平。

表1 Plackett-Burman设计各因素水平Table1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

Plackett-Burman试验设计中，应用线性函数进行因素筛选并忽略相互作用。对软件拟合的线性方程进行方差分析及显著性分析，评价各因素的效应及重要性。

1.3.3 CCD方法对主要因素水平的筛选

由Box和Wilson开发的CCD可通过最少的实验来拟合响应面模型，每个因素通常设计5个水平，一般采用二阶经验模型对变量的响应行为进行表征[12]。

应用Design Expert软件，采用CCD方法，对Plackett-Burman筛选出的4个主要因素(酵母膏质量浓度、葡萄糖质量浓度、硫酸锰质量浓度和培养温度)进行试验设计(表2)。同时根据Plackett-Burman设计拟合出的线性方程，若偏回归系数为正值表明该因素起正效应，取高水平；若系数为负值则表明该因素起负效应，取低水平，固定其他非关键因素。

表2 CCD各因素水平Table2 Factors and levels in the central composite design

2 结果与分析

2.1 菌体生长氮源选择试验结果

图1 不同氮源对菌体质量浓度的影响Fig.1 Effect of nitrogen source type on the growth of L.reuteri CG001

由图1可以看出，不同氮源对菌体质量浓度的影响较大，综合成本最低和满足菌体生长需要两方面考虑，酵母膏作为氮源最合适。

2.2 Plackett-Burman设计试验结果

应用Design Expert软件对表3中菌体质量浓度进行回归分析，得到各影响因素的偏回归系数及其显著性，结果见表4。

表4 偏回归系数及影响因素的显著性分析Table4 Partial regression coefficients and corresponding significance analysis

式中：Y为菌体质量浓度/(g/L)；A、B、C、D、E、F、G、J、L分别表示Plackett-Burman设计中各因素的水平。

由表4可以看出，此模型的F值是24.28，表明该拟合模型很显著，并且仅仅只有4.02% 的机会是由于噪声引起的。方差分析模型的Prob＞F值为0.0402小于0.05，表明所得回归方程显著，即该模型的整个回归区域拟合较好；复相关系数R2=0.9909，说明相关性很好；校正决定系数R2Adj=0.9501，表明95.01%试验数据的变异性可用此回归模型来解释；通常情况下变化系数(C V)越低实验的可信度和精确度越高，本试验CV=4.80，表明Plackett-Burman试验的可信度和精确度很好；精密度(adeq precision)是有效信号与噪声的比值，

表3 Plackett-Burman试验设计结果Table3 Plackett-Burman design matrix and experimental results

大于4.0视为合理，本试验精密度达到14.972。另外，通过偏回归系数的正负值确定非关键因素如下：柠檬酸铵质量浓度1g/L、醋酸钠质量浓度7g/L、磷酸氢二钾质量浓度3g/L、硫酸镁质量浓度0.2g/L、吐温-80质量浓度1g/L、初始pH6.2。

2.3 CCD试验结果与响应面分析

表5 CCD试验结果Table5 Central composite design matrix and experimental results

式中：Y为响应值，即菌体质量浓度/(g/L)；A、B、C分别为酵母膏质量浓度/(g/L)、葡萄糖质量/(g/L)浓度和硫酸锰质量浓度/(g/L)；D为培养温度/℃。

对二次模型的方差分析见表6。

表6 CCD试验结果二次模型的方差分析Table6 Variance analysis for the developed regression model

由表6可知，F值为4.12，多元相关系数为R2=0.9058，说明模型对实际情况拟合比较好；Prob＞F值为0.0455，表明该模型拟合效果显著。

表7 二次模型回归方程系数显著性检验Table74 Significance test for coefficients of the developed regression model

二次模型中回归系数的显著性检验(表7)表明：Prob＞F值为0.0334，小于0.05，所以因素A对菌体质量浓度的线性效应显著；而因素B、C、D不显著；Prob＞F值为0.0487，小于0.05，所以因素D2对菌体质量浓度的曲面效应显著，而因素A2、B2和C2不显著；AB、AC、AD、BC、BD、CD对菌体质量浓度的交互影响都不显著。

应用Design Expert软件对多元回归方程(2)绘制响应曲面图及其等高线图。对任何两因素交互影响L.reuteriCG001的菌体质量浓度进行分析与评价，以确定最佳因素水平，结果见图2～7。根据响应面法原理，当等高线图为椭圆或圆时，它的中心是响应值的最大值或最小值，若未出现，则说明各因素交互作用不显著。

图2 酵母膏和葡萄糖对菌体质量浓度交互影响的响应面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots illustrating the cross-interaction effect between yeast extract and glucose on the growth of L.reuteri CG001

图2显示，酵母膏质量浓度和葡萄糖质量浓度对菌体质量浓度的交互影响不显著。

图3 酵母膏和硫酸锰对菌体质量浓度交互影响的响应面图和等高线图Fig.3 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between yeast extract and manganese sulfate on the growth of L.reuteri CG001

图3显示，酵母膏质量浓度和硫酸锰质量浓度对菌体质量浓度的交互影响不显著。

图4 酵母膏和培养温度对菌体质量浓度交互影响的相应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between yeast extract and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

图4显示，酵母膏质量浓度和培养温度对菌体质量浓度的交互影响不显著。

图5 葡萄糖和硫酸锰对菌体质量浓度交互影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between glucose and manganese sulfate on the growth of L.reuteri CG001

图5显示，葡萄糖质量浓度和硫酸锰质量浓度对菌体质量浓度的交互影响不显著。

图6 葡萄糖和培养温度对菌体质量浓度交互影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between glucose and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

图6显示，葡萄糖质量浓度和培养温度对菌体质量浓度的交互影响不显著。

图7 硫酸锰和培养温度对菌体质量浓度交互影响的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots illustrating the cross interaction effect between manganese sulfate and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

图7显示，硫酸锰质量浓度和培养温度对菌体质量浓度的交互影响极显著，因为这是表5中21组实验以外的情况，存在稳定点并有最大值，对二次方程(2)求一阶偏导得出坐标(C，D)=(0.3，0.73)，即硫酸锰质量浓度为0.23g/L，培养温度为38.6℃。

综合Plackett-Burman试验设计结果及响应面分析，取软件设计中的10组优化条件中最好的一组(取值与上述不同)，确定最优培养条件为：酵母膏质量浓度20g/L、葡萄糖质量浓度20g/L、硫酸锰质量浓度0.23g/L、培养温度38.6℃，理论计算菌体质量浓度为0.997g/L。

2.4 验证实验

按照优化后L.reuteriCG001的培养条件：酵母膏质量浓度20g/L，葡萄糖质量浓度20g/L，柠檬酸铵质量浓度1g/L，醋酸钠质量浓度7g/L，磷酸氢二钾质量浓度3g/L，硫酸锰质量浓度0.23g/L，硫酸镁质量浓度0.2g/L，吐温-80质量浓度1g/L，初始pH6.2，培养温度38.6℃，进行验证实验，实测菌体质量浓度达到0.984g/L，与预测菌体质量浓度0.997g/L较接近，预测精度达98.69%，且最终菌体质量浓度是优化前的1.102倍。这证明了Plackett-Burman设计和CCD方法联用的可行性，也证明了响应面法应用于培养基优化的高效性。

2.5 发酵罐厌氧培养L.reuteri的生长代谢曲线与分析

图8 5L发酵罐中L.reuteri CG001的生长曲线Fig.8 Growth curve of L.reuteri CG001 in a 5 L fermentor

图8显示，5L发酵罐厌氧培养L.reuteriCG001 的生长曲线呈S型，4～12h菌体处于对数生长期，之后趋于平衡，即可收获菌体。

图9 发酵液中葡萄糖、乳酸、乙酸和乙醇质量浓度随时间变化曲线Fig.9 Concentration versus time curves of glucose, lactic acid, acetic acid and ethanol during fermentation

从图9可以看出，发酵上清液中葡萄糖的质量浓度明显下降至接近零，可知它的消耗速率与菌体的生长速率相对应；乳酸和乙醇是葡萄糖代谢的产物，它们的质量浓度都在上升，而乳酸产量居多；乙酸的质量浓度从始至终变化不大，可能是因为培养基本身含有乙酸钠，发酵过程 pH值 通过调节一直恒定在5.5左右导致的。菌体二步法转化甘油制备3-HPA的研究中，第一步就是在最适菌生长的条件下获得大量菌体，所以本实验对L.reuteri的培养基进行优化并对其生长代谢作基础研究，这是二步法的前提。

3 结 论

大量前期的研究中罗伊氏乳杆菌的MRS培养基是富集培养基，组分较多，成本较高，实验操作复杂。本实验先用单因素法优化氮源，再结合Plackett-Burman与CCD设计筛选出最优配方，减少了培养基组分，降低了部分成本，使操作简单化，并增加了菌体产量。

本实验结果证明：Plackett-Burman设计方法可从影响培养基的多种组分中高效地筛选出关键因素；CCD设计和 RSM分析可实现关键因素的合理优化，在降低培养基氮源成本的情况下，实测菌体质量浓度达到0.984g/L，接近预测值0.997g/L，且最终菌体质量浓度是优化前的1.102倍。

用最优条件在5L发酵罐中厌氧培养的L.reuteriCG001的生长曲线呈S型，4～12h是菌体的对数生长期，之后趋于平衡，即可收获菌体。

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