随着医药学和生命科学的发展，人们逐渐发现药物对映异构体在药理、毒理和临床疗效等方面存在着较大的差异，因此药物对映体的拆分工作具有重要意义。克伦特罗(Clenbuterol)是β2肾上腺受体激动剂，主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛[1]，其结构式见图1。

图1 克伦特罗的结构式

克伦特罗分子中含有一个手性中心，目前临床上应用的克伦特罗均为外消旋体，但研究表明临床上有效的一般为其(-)-异构体，而(+)-异构体则对疗效没有贡献[2]。目前，关于克伦特罗单一对映体的药理活性、药代动力学研究罕见文献报道，建立克伦特罗手性分离方法对深入研究其对映体的药效、药理作用具有重要意义。因此，有必要对克伦特罗对映体进行拆分研究，建立快速、灵敏、分离性能好的测定方法。

目前，药物的拆分方法主要有高效液相色谱法和毛细管电泳法。宋雅茹等[3]将酰胺型手性固定相用于高效液相色谱拆分克伦特罗对映体；唐琴等[4]用Whelk-O1手性固定相成功拆分了克伦特罗对映体；黄可龙等[5]用毛细管电泳法以羟丙基-β-环糊精为手性添加剂拆分了克伦特罗。但至今还没有关于利用替考拉宁手性固定相对克伦特罗进行手性拆分的报道。替考拉宁手性固定相的结构式如图2所示。

图2 替考拉宁手性固定相结构式

作者首次采用替考拉宁手性固定相对克伦特罗对映体进行了分离，并从结构上探讨了手性分离的机制。

1 实验

1.1 试剂与仪器

盐酸克伦特罗，青岛双鲸药业；甲醇(MeOH)、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃，色谱纯，天津市康科德科技有限公司；冰醋酸(HAc)、三乙胺(TEA)、硝酸铵，特级纯，天津市博迪化工有限公司。

Jasco UV-980型高压输液泵、Jasco UV-975型检测器，Jasco 日本分光公司；IC 2001 plus 型柱温箱；Anastar 色谱工作站，U6K型进样阀(20 L定量环)；DT-100A型分析天平；PHS-25型pH计；DL-180型超声波清洗机。

1.2 色谱条件及分离影响

药物对照品用甲醇溶解，配制成浓度为1.0 mg·mL-1的供试液。

色谱柱:Chirobiotic T (150 mm×4.6 mm ,5 μm) (Advanced Separation Technologies Inc．，美国);流速:1.0 mL·min-1；紫外检测波长:254 nm；进样量:2 μL。

考察分离模式、流动相组成、柱温等因素对克伦特罗对映体分离的影响。

2 结果与讨论

2.1 分离模式的选择

替考拉宁手性固定相有正相、反相和新极性有机相三种分离模式。

在正相模式下，考察了两种流动相系统:正己烷/乙醇和正己烷/异丙醇，并通过改变流动相组成以实现手性分离。结果发现，在此模式下，克伦特罗对映体在替考拉宁手性固定相上不能实现分离。

在反相模式下，首先采用厂家建议的0.1%TEA(pH值4.1)-20%甲醇为流动相，考察了克伦特罗保留行为和选择性受有机改性剂的性质和浓度、缓冲溶液的性质、浓度和pH值的影响，但通过优化这些分离条件，克伦特罗对映体在替考拉宁手性固定相上均不能实现分离。

在新极性有机相模式下，克伦特罗对映体可获得分离，因此，选择分离模式为新极性有机相。

2.2 缓冲溶液的选择

在新极性有机相模式下，考察了醋酸铵、硝酸铵和1%醋酸-三乙胺缓冲系统对分离的影响，结果发现，克伦特罗在1%醋酸-三乙胺缓冲系统中可以实现手性分离。

2.3 流动相组成的确定

以1%醋酸-三乙胺为缓冲系统，以甲醇-冰醋酸-三乙胺系统作为流动相，考察了冰醋酸和三乙胺的浓度和比例对分离的影响。结果发现，在替考拉宁手性固定相上，当流动相只含冰醋酸时，克伦特罗只能检测到一个变形的色谱峰，不能实现手性分离；在只含三乙胺的流动相中，克伦特罗对映体可实现一定的分离，但峰形不佳；在三乙胺存在的前提下，冰醋酸的加入可以改善色谱峰的峰形和对称性，两者比例为1∶1时克伦特罗对映体的分离效果最佳。因此，本实验采用甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.1∶0.1,体积比)为起始流动相，考察了缓冲溶液成分(冰醋酸/三乙胺)的浓度对克伦特罗在替考拉宁手性固定相上保留行为和对映体选择性的影响，结果见表1。

表1 新极性有机相模式下流动相组成对克伦特罗对映体在替考拉宁手性固定相上分离效果的影响

注：流速为 1.0 mL·min-1， 柱温为20℃

由表1可知，随着冰醋酸/三乙胺的浓度从0.1%降低至0.02%或0.01%，克伦特罗的保留时间明显延长，分离效果显著提高；但当冰醋酸/三乙胺的浓度继续降低至0.005%时，克伦特罗的保留时间过长，色谱峰展宽，分离效果下降。当甲醇-冰醋酸-三乙胺的体积比为100∶0.01∶0.01时，克伦特罗对映体可实现基线分离，最大分离度达3.75，分离色谱图见图3。因此，确定最佳流动相为甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01，体积比)。

注：流动相为甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,体积比)，流速为1.0 mL·min-1，柱温为20℃

2.4 柱温的选择

柱温对分离度和保留时间有着重要的影响。以甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,体积比)为流动相，考察了克伦特罗对映体在10℃、20℃、30℃和40℃下的分离情况，结果见表2。

表2 温度对克伦特罗在替考拉宁手性固定相上分离效果的影响

由表2可知，随着温度的升高，克伦特罗的保留时间和对映体选择性均相应降低，权衡分离度、保留时间及实际操作性，选取最佳分离温度为20℃。

2.5 分离机制的探讨

替考拉宁分子中含有多种官能团和不对称中心，可与被分析物质产生多种作用，如疏水作用、包合作用、偶极-偶极作用、π-π诱导作用、氢键作用、空间位阻作用及范德华相互作用。克伦特罗的结构中含有苯环、羟基、卤素和氨基基团，可以与手性选择剂上相应的官能团发生相互作用从而实现手性分离。新极性有机相模式可以提升这些相互作用，因此在此模式下，克伦特罗对映体达到了在正相和反相模式下不能实现的分离效果。而在新极性有机相模式下，必须有三乙胺存在于流动相中才可实现克伦特罗对映体的分离，当流动相中同时含有三乙胺和冰醋酸时，分离效果最佳，这说明离子作用是此模式下对映体分离的最主要作用机制，而克伦特罗的手性分离是上述提到的各种相互作用的共同结果。

3 结论

采用替考拉宁手性固定相成功实现了克伦特罗对映体的直接分离，确定最佳色谱条件为：流动相为甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01，体积比)，流速1.0 mL·min-1，柱温20℃。在此条件下，克伦特罗对映体可实现基线分离，最大分离度达3.75。该方法简单，操作方便，可以用于克伦特罗对映体的质量控制及立体选择性药代动力学的研究。

参考文献：

[1] 孙定人,张石革,梁之江.国家临床新药集[M].北京:中国医药科技出版社,2001:358-359.

[2] Gausepohl C,Blaschke G.Stereoselective determination of clenbuterol in human urine by capillary electrophoresis[J].Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications,1998,713(2):443-446.

[3] 宋雅茹,王德发,杨亦平,等.酰胺型手性固定相直接拆分克伦特罗对映体[J].色谱，2002,20(2)：118-120.

[4] 唐琴,宋航,付超,等.高效液相色谱手性固定相法拆分克伦特罗对映体[J].分析化学,2004,32(6):755-758.

[5] 黄可龙,胡卫国,王蔚玲,等.高效毛细管电泳对克伦特罗对映体的分离及定量检测[J].分析科学学报，2007,23(1)：9-12.