(雀巢研发中心上海有限公司，上海 201812)

双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等被称为益生菌，近几年来一直受到广泛的关注。大量发酵和未经发酵的奶制品，如牛奶、酸奶、冰淇淋和奶酪等都可以为人体提供这种有益菌。但同时，由于它们对生存环境有着极高的要求(极度厌氧环境下生长和抗酸性环境能力差)，很难在产品中保持较高的活菌数。因此，目前的研究更多地关注于在不适合的生长环境下益生菌的表现，以拓宽益生菌在工业生产中的应用并降低生产过程中的成本。

当有大量活菌存在时，益生菌具有抑制Clostridiumperfringens、Salmonellatyphimurium、Listeriamonocytogenes、Campylobacterjejuni、Bacteroidesvulgatus和Escherichiacoli等致病菌的作用，许多研究认为这是由于其自身代谢产生的有机酸、过氧化氢、抗菌素和其它抑菌成分所造成的[1]。大肠埃希菌O157:H7是非常常见的食源性致病菌，受感染的人会有严重的腹泻、腹痛和发烧等症状。鉴于它极强的致病性(尤其是对青少年和老年人)和生存能力，在食品中是不能检出的[2]。

虽然研究已经证实了益生菌对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用，但是它们都强调了大量活菌数和厌氧条件(尤其对双歧杆菌)的必要性。而对于益生菌(主要是双歧杆菌)在有氧条件下对于大肠埃希菌O157:H7的影响却很少涉及。因此，本研究旨在了解益生菌混合物在利于大肠埃希菌O157:H7生长的条件(37℃， 有氧)下对该致病菌的影响，具体考察培养基的pH值和益生菌(主要是双歧杆菌)有氧状态下的代谢产物在其中所起到的作用。

1 实验

1.1 菌株

5株益生菌：Bifidobacteriumlactis/animalis、B.bifidum、B.longum、Lactobacillusacidophilus，Chr.Hansen 。大肠埃希菌(Escherichiacoli)O157:H7(ATCC 43890) 由Juan L.Silva(Mississippi State University, MS, USA) 博士提供。

1.2 细菌细胞的处理

所有菌株都在含有50%甘油和11%脱脂牛奶的冻藏管中-80℃下储藏。益生菌在MRS肉汤(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)中，37℃、厌氧条件下复活和复壮[3]。大肠埃希菌O157:H7在TSB肉汤(Becton Dickinson)中，37℃、有氧条件下复活复壮[4]。每次实验之前菌株都必须经过12 h的培养，然后用0.85%的盐水离心(1000 g，4℃, 2 min)清洗2次。在0 h、4 h(快速生长阶段)、8 h(平稳生长阶段)和24 h取样，使用TSA(Becton Dickinson)平板来记录大肠埃希菌O157:H7的活菌数(log CFU·mL-1)。

1.3 益生菌对大肠埃希菌O157:H7生长的抑制作用的研究

将益生菌混合物(5株)和10 μL大肠埃希菌O157:H7分别接入10 mL 11%的脱脂牛奶和MRS肉汤中，在37℃、 100 r·min-1振荡(C24型温控摇床)培养24 h。培养过程中监控大肠埃希菌O157:H7的活菌总数和培养基的pH值。

1.4 低pH值环境对大肠埃希菌O157:H7生长的影响研究

将10 μL大肠埃希菌O157:H7分别接入用1 mol·L-1氢氧化钠调酸的11%脱脂牛奶(pH值3.8)和MRS肉汤(pH值3.9)中[5]，在37℃、 100 r·min-1振荡培养24 h。和在未经调酸的11%脱脂牛奶(pH值6.4)和MRS肉汤(pH值6.5)中培养生长情况比较。

1.5 益生菌对经过酸适应的大肠埃希菌O157:H7抑制作用的研究

将大肠埃希菌O157:H7接入1 mL TSB肉汤(多加入10 g·L-1葡萄糖，用1 mol·L-1氢氧化钠调pH值至4.8)，在37℃、100 r·min-1振荡培养24 h，得到经过酸性环境适应的酸适应大肠埃希菌O157:H7，用0.85%盐水离心(1000 g，4℃, 2 min)清洗2次，然后取10 μL和益生菌混合物一起接入11%脱脂牛奶中，在37℃、 100 r·min-1振荡培养24 h。以10 μL酸适应大肠埃希菌O157:H7直接接入11%脱脂牛奶中在37℃、100 r·min-1振荡培养24 h作为参照，比较大肠埃希菌O157:H7的生长情况。

1.6 益生菌在有氧状态下的代谢产物对大肠埃希菌O157:H7抑制作用的研究

益生菌混合物接入新鲜的MRS肉汤中，在37℃、100 r·min-1振荡培养8 h，离心(30 000 g，4℃, 20 min)，用0.22 μm的滤纸抽真空过滤得到无菌的澄清液，将澄清液分成两份，其中一份用6 mol·L-1氢氧化钠调pH值至6.5(新鲜MRS肉汤的pH值)。10 μL大肠埃希菌O157:H7被分别接入这两份澄清液中，然后在37℃、100 r·min-1振荡培养24 h[6]。

1.7 统计分析

每个实验重复3次，得到平均值和标准方差。用Fisher的LSD(Least significance difference)实验判断方法判断样品之间是否有显著差异(P≤0.05)(SAS 9.0版本; SAS, 2004)。

2 结果与讨论

2.1 益生菌对大肠埃希菌O157:H7生长的抑制作用(表1、图1)

表1 有氧状态下益生菌在11%脱脂牛奶和MRS肉汤中对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用(n=3)

图1 有氧条件下益生菌混合物和大肠埃希菌O157:H7在MRS肉汤中培养时，大肠埃希菌O157:H7的生长(a)和MRS肉汤pH值(b)的变化情况(n=3)

由表1可知，没有加益生菌的脱脂牛奶中，大肠埃希菌O157:H7经过8 h培养，总菌数从约6 log CFU·mL-1增加到了约8 log CFU·mL-1。而加了益生菌的脱脂牛奶中，总菌数从约6 log CFU·mL-1降低到了约1 log CFU·mL-1。由于MRS肉汤适于益生菌的生长，所以用MRS肉汤为培养基，重复了以上的实验，结果极为相似:在加了益生菌的MRS肉汤中，大肠埃希菌O157:H7经过8 h培养，总菌数达到了不可检出。从以上结果可以看出，无论活菌的含量多少，益生菌对大肠埃希菌O157:H7的生存生长起着抑制的作用。

由图1可知，大肠埃希菌O157:H7在加了益生菌的MRS肉汤中培养8 h时已经不可检出，因此，将MRS肉汤在第8 h的pH值作为后续实验中调整培养基pH值的标准，用来研究低pH值环境对大肠埃希菌O157:H7生长的影响，而8 h也作为益生菌在MRS肉汤里有氧条件下的培养时间，以便研究益生菌在有氧状态下代谢产物对大肠埃希菌O157:H7生长的影响。

2.2 低pH值环境对大肠埃希菌O157:H7生长的影响(图2)

图2 大肠埃希菌O157:H7在酸性环境和在益生菌共存的有氧环境中的生长情况(n=3)

由图2可知，低pH值环境和益生菌混合物均对大肠埃希菌O157:H7的生长有抑制作用。资料显示大肠埃希菌O157:H7能够存活的最低pH值在4.0～4.5之间[7]，本次实验得到了类似的结果，进一步研究发现，益生菌混合物对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用比低pH值环境更为迅速。

2.3 益生菌对经酸适应的大肠埃希菌O157:H7的抑制作用(图3)

图3 酸适应和未经酸适应的大肠埃希菌O157:H7在和益生菌共存的11%脱脂牛奶中有氧状态下的生长情况(n=3)

经过酸适应的大肠埃希菌O157:H7在低pH值环境下拥有更强的存活能力[8]，同时抵抗其它环境压力的能力也更高于未经酸适应的大肠埃希菌O157:H7[9]。因此经酸适应的大肠埃希菌O157:H7和益生菌混合物一起被接入11%的脱脂牛奶中，在37℃、100 r·min-1振荡培养24 h。本次实验结果(图3)显示经酸适应的大肠埃希菌O157:H7在抵抗益生菌方面的能力并没有提高。

2.4 益生菌在有氧状态下的代谢产物对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用(图4)

图4 低pH值环境和益生菌有氧状态下的代谢产物对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用(n=3)

由图4可知，将澄清液的pH值调回6.5(新鲜MRS肉汤的pH值)，大肠埃希菌O157:H7生长较好，这表明低pH值是抑制其生长的最主要因素，同时也证明了益生菌的酸类代谢产物(如乙酸)[10]降低了环境的pH值从而达到了抑制大肠埃希菌O157:H7生长的目的。并且，由于大肠埃希菌O157:H7在pH值4.4的澄清液中死亡速度反而比在pH值3.9的新鲜MRS肉汤中更快，表明益生菌在有氧状态下的其它代谢产物也同时对大肠埃希菌O157:H7的死亡起着推进作用。

许多研究支持了这个假设:双歧杆菌B.longum的代谢产物被报道具有阻碍大肠埃希菌O157:H7吸附肠道上皮细胞的功能[11]；益生菌在有氧状态下的代谢产物的组成可能与益生菌含有6-磷酸果糖磷酸酮酶有关。该酶能将葡萄糖转化为醋酸和乳酸，同时也能将氧气转化为许多不同的物质(如超氧和过氧化氢)，从而导致了双歧杆菌不能在有氧状态下存活[12]。醋酸、乙酸和过氧化氢都有抑制大肠埃希菌O157:H7的作用[13]，而这三种物质也能被氢氧化钠在调整pH值时中和。因此这三种物质是最有可能在澄清液中造成大肠埃希菌O157:H7死亡的主要原因之一。以上假设需要进一步的实验进行论证。

3 结论

益生菌混合物(5株)在11%脱脂牛奶和MRS肉汤中对大肠埃希菌O157:H7的生存生长有抑制作用。酸性环境是阻碍大肠埃希菌O157:H7生存生长的主要原因之一。而益生菌在有氧状态下的代谢产物是加速大肠埃希菌O157:H7死亡的另一个主要原因，这些代谢产物有可能被氢氧化钠中和或者是在低酸性环境下失去作用。需要用进一步的研究来确定这些代谢产物的组成和成分。

参考文献：

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