陈 芳 黄京平 王 鹏 张金振 赵 静 李 熠

（中国农科院蜜蜂研究所，国家农产品加工中心蜂业分中心，北京100093）

1 前言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露与自身分泌物结合后，经过在巢脾内转化、脱水、贮存至成熟的天然甜物质[1]。蜂蜜因具有较高的营养价值深受人们喜爱。近年来，随着人民生活水平的提高和保健意识的增强，国内消费市场也在日益增大，蜂蜜真实性已成为政府重视、社会关注和人民关心的热点问题，也是困扰行业发展的关键问题。

行业自律是维护蜂蜜真实性的根本之道，但与时俱进的国家标准及检测技术是保障蜂蜜真实性的不可或缺的有力砝码。国家质量监督检验检疫总局颁布的《蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法稳定碳同位素比率法》(GB/T18932.1-2002)和2005年颁布的强制性国家标准《蜂蜜》（GB18796-2005），对保障蜂蜜真实性和维护蜂产品行业及市场秩序都产生了积极的作用。但随着造假技术的不断深入，单一的检测技术及评判指标已不适应维护蜂蜜真实性的需求，需要认真地调查我国市场蜂蜜产品的现状，分析研究各项基础数据以提供科学有效的应对技术。

本研究从全国17个主要蜂蜜产区的代表城市抽取相当数量的蜂蜜样品，通过液相色谱、稳定同位素质谱等先进的仪器分析蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖（以下简称蜂蜜四糖）及碳同位素比值。描述分析数据的基本情况及可能的真实性现状，并对数据进行统计分析，包括描述性分析、独立样本T检验及因子分析（主成分分析）等，提炼出更为科学合理的真实性评价指标。

2 材料与方法

以下方法均采用国家标准GB/T18932.1-2002[2],GB/T18932.22-2003[3]。

2.1 材料与试剂

果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品购于美国Sigma公司。橄榄油标准品购于英国Elemental Microanalysis公司。乙腈（色谱级），钨酸钠、硫酸均为优级纯。流动相用水为超纯水，样品前处理用水为去离子水。

2.2 仪器与设备

Waters2695液相色谱仪，2414示差检测器；SerCon EA-Hydra20-20稳定同位素比例色谱仪；Milli-Q超纯水仪；恒温水浴锅；高速离心机。

2.3 样品的采集

330个蜂蜜样品采自十几个省、市、自治区的市场或超市，具体情况如下：安徽省（19个）、北京市（79个）、福建省（8个）、广东省（10个）、广西壮族自治区（17个）、河北省（11个）、河南省（10个）、湖北省（23个）、江苏省（16个）、江西省（13个）、辽宁省（19个）、山东省（19个）、上海市（32个）、四川省（21个）、天津市（7个）、浙江省（26个）。

2.4 试剂及标线配制

2.4.1 果糖、葡萄糖标准储备溶液：准确称取5g果糖标准物质和4g葡萄糖标准物质，精确至0.0001g，放入同一100ml容量瓶中，加入60ml水溶解，用乙腈定容至体积，摇匀。

2.4.2 蔗糖、麦芽糖标准储备溶液：分别称取2g蔗糖和2g麦芽糖标准物质，精确至0.0001g，放入同一100ml容量瓶中，加入60ml水溶解，用乙腈定容至体积，摇匀。

2.4.3 标准曲线的绘制：吸取不同体积的果糖、葡萄糖标准储备溶液和蔗糖、麦芽糖标准储备溶液，用乙腈+水（40+60）稀释至体积，配成不同浓度的蜂蜜四糖标准工作溶液，用于绘制标准工作曲线。如下表：

表1 绘制标准工作曲线用的标准溶液浓度、用量

2.4.4 10%钨酸钠溶液：称取10g钨酸钠，用水定容至100ml。

2.4.5 0.335mol/l硫酸溶液：移取9.4ml硫酸，用水定容至 500ml。

2.4.6 取1.0μl橄榄油标准品于8mm×5mm锡杯中，密封用于测定蛋白质样品；取2.0μl橄榄油标准品于8mm×5mm锡杯中，密封用于测定蜂蜜样品。

2.5 样品的制备

2.5.1 蜂蜜四糖样品的制备：称取5 g试样，精确至0.001g。置于100 ml烧杯中，加入30 ml水，用玻璃棒搅拌使试样完全溶解，转移至100ml容量瓶中，然后再用3×10ml水洗烧杯并转移至上述100ml容量瓶中，用乙腈定容至体积，混匀。用0.45μm滤膜将样液过滤入样品瓶中，用液相色谱-示差折光检测器测定。

2.5.2 蜂蜜中C-4植物糖样品的制备：称取蜂蜜样品10～12g于50ml离心管中，加入4ml水混匀，在一支20ml量筒中加入2.0ml10%钨酸钠溶液和2.0ml0.336mol/l硫酸溶液，迅速混匀后，加到上述盛蜂蜜样品的离心管中，混匀。置于80℃水浴中加热不少于30min，在加热过程中，每隔5～10min旋转混合离心管中内容物20s，直到有絮状物析出。

以水注满离心管并混合，在RCF1500×g下离心5min，倾掉上层清液，再以约50ml水充分洗涤沉淀物并离心，如此反复洗涤沉淀物5次，最后刀杆上清液，将含有沉淀蛋白质的离心管置于75℃烘箱中干燥3h以上,备用。

称取上述烘干的蛋白质3.0mg，于8mm×5mm锡杯中，密封备用；移取3.0μl蜂蜜样品于8mm×5mm锡杯中，密封备用；蛋白质及蜂蜜样品均制备平行样。

2.6 仪器参数及样品测定

2.6.1 液相色谱条件：色谱柱：色谱柱为Carbohydrate(250mm×4μm×4.6 i.d)或相当者；流动相：乙腈+水（77+23）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测器池温度：35℃；进样量：15 μl。

2.6.2 稳定同位素比例色谱仪条件：载气：氦气（99.999%）；助燃气：氧气（99.999%）；燃烧炉温度：1000℃；反应炉：600℃；色谱柱温度：70℃。

2.7 数据分析

蜂蜜四糖及C-4植物糖均参见国家标准中的结果计算方法计算结果。所有数据均采用SPSS统计软件进行统计分析，包括描述性分析、独立样本T检验、因子分析（主成分分析）等。

3 结果与讨论

3.1 市场蜂蜜真实性现状

以国家标准中规定的果糖、葡萄糖之和（即还原糖含量）大于60%，蔗糖含量低于5%，C-4植物糖含量小于或等于7%为合格计，共有83个样品不合格，其中18个是还原糖含量和C-4植物糖均不合格，6个还原糖含量不合格，但C-4植物糖含量却合格，59个还原糖含量合格但C-4植物糖不合格，无蔗糖不合格样品。

由此可推见我国目前蜂蜜市场现状大致可归纳为以下几点：1.产品合格率低，仅为74.8%；C-4植物糖不合格是蜂蜜样品不合格的主要表现形式，C-4不合格率占总不合格样品的92.8%。2.还原糖不合格的样品仅为很小一部分，无蔗糖不合格样品。3.市场的不合格样品中以掺假居多，完全造假行为（即以无蛋白析出样品计）较少，仅占总样品量的1.81%。4.市场出现了很大一部分以非C-4植物糖为原料的掺假蜂蜜，现有的国家标准无法约束。目前我国现行的国家标准是用稳定同位素质谱法测定蜂蜜中C-4植物糖含量，因此只能计算出添加的C-4植物糖含量，不能约束非C-4植物糖的添加物。而国际通用的ISCIRA指数是指δ13CH与δ13CP的差值的绝对值小于1，表明的是纯天然蜂蜜δ13CH与δ13CP的离散程度，可以在一定程度上对非蜂蜜添加物进行约束。因此以ISCIRA指数计，不合格数为132个，且这132个不合格样品中涵盖了所有还原糖不合格样品。由此可见，ISCIRA指数对目前我国蜂蜜市场上出现了很大一部分非C-4植物糖掺假的蜂蜜样品，具有一定的约束力。

3.2 蜂蜜样品产品指标的统计分析

虽然，目前我们已经运用了先进的仪器设备和检测技术对蜂蜜质量进行监管，但由于巨大的商业潜力及造假技术的不断深入，单一的检测技术及判定指标很难对蜂蜜真实性进行鉴别，因此我们应该提取更多的判定指标，对蜂蜜的真实性进行更为严格的限定，以保障蜂蜜市场的有序。根据上述现状，以果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、还原糖、果葡比、δ13CH、δ13CP、ISCIRA 指数等 9 个指标为统计对象，重点研究不合格与合格样品各项指标的差异及合格样品可能的代表性指标。探索性描述分析结果表明（见图1），合格样品组较不合格样品组具有各个指标的分布范围更集中，且符合更好的正态分布模型等特征。独立样本T检验发现，果糖、葡萄糖、麦芽糖、δ13CH值和δ13CP值组间平均值差异显著，蔗糖组间均值差异不显著。合格组的果糖、葡萄糖平均值显著高于不合格组，麦芽糖、δ13CH、δ13CP值显著低于不合格组均值，合格组δ13CH、δ13CP均值分别为-24.14‰和-24.16‰，低于-23.5‰（目前认为的掺假界限[4]），而不合格组 δ13CH、δ13CP的均值分别为-22.20‰和-22.84‰，高于-23.5‰。

图1 合格样品与不合格样品8项指标正态分布图差异比较

对合格样品及不合格样品的因子分析得出的统计模型（图2）发现，不合格样品提取出了3个公因子，分别为还原糖含量、ISCIRA指数及C-4植物糖含量。代表了用于描述不合格蜂蜜样品性状的指标仅为糖的含量、蜂蜜与蜂蜜蛋白质碳同位素比值的接近程度和C-4植物糖含量。现行国家标准中对蜂蜜中还原糖含量及C-4植物糖含量已经有了标准限定，但这两项指标对目前市场上出现的非C-4植物糖型的掺假行为不具备约束力，统计模型中第二公因子ISCIRA指数的提出证明了ISCIRA值更利于描述蜂蜜真实性，因为ISCIRA指数所表达的意义已经涵盖并延伸了现行国家标准中C-4植物糖含量的规定。合格样品提取出了4个公因子，分别为果葡比、还原糖含量、ISCIRA指数和δ13CP值，说明了用于描述合格样品性状的指标应包括蜂蜜中糖的构成、糖的含量、蜂蜜与蜂蜜蛋白质碳同位素比值的接近程度及蜂蜜蛋白值的同位素比值。在合格样品和不合格样品中均有提取到公因子还原糖含量和ISCIRA指数，但合格样品多了果葡比和δ13CP值，其中δ13CP值因其稳定及检测效果好而被认定为蜂蜜碳同位素比值测定法的内标物[5]。也就是说，即使糖的含量和蜂蜜与蜂蜜蛋白质碳同位素比值的接近程度符合标准要求，也不一定表明是真实的蜂蜜样品，还应该对不同品种蜂蜜的果葡比及δ13CP值进行深入的研究，给出合理的范围，才有利于蜂蜜真实性及品质鉴别。

图2 合格样品(A)与不合格样品(B)因子分析成分得分系数矩阵图

4 展望

由于我国蜜源植物丰富，且地域辽阔，气候、环境条件差异十分显著，因此，不同地区、不同品种的蜂蜜样品的糖的含量、构成及δ13CP值将会有很大的差异。在未来的研究中，我们应深入细致地调查蜂蜜品种、地域在糖的含量、构成，δ13CP值和ISCIRA指数等指标上的差异，给出合理的范围值，细化标准，为蜂蜜质量与品质监督检验提供技术支持。

［1］中华人民共和国国标GB18796－2005.

［2］中华人民共和国国标《蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法稳定碳同位素比率法》GB/T18932.1－2002.

［3］中华人民共和国国家标准《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖测定方法液相色谱法》GB/T18932.22-2003.

［4］朱青，王毕妮，梁艳，陈卫军，曹炜.蜂蜜掺假检测方法的研究进展[J].中国蜂业 2008，59（10）：35-37.

［5］胡福良.碳稳定同位素比值分析法(SIRA)在蜂蜜质量鉴别中的应用[J].中国养蜂 2000，51（6）：21-22.