陈 陵,梁光萍,汤旭东,余松涛,黎 川,李 宁,李长珠,王国珍,房殿春,杨仕明

(1.第三军医大学西南医院全军消化病研究所;2.第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,重庆,400038)

端粒(telomere)是存在于染色体末端的一种特殊结构,人和其它脊椎动物的端粒DNA均为(5′-T TAGGG-3′)n,大小5～ 20 kb[1]。每次细胞有丝分裂后,端粒都会缩短,缩短到一定程度后细胞就不可避免的发生衰老死亡[2]。因此,能无限分裂增殖的细胞必定有延长其端粒的能力,这一能力在绝大多数情况下正是通过端粒酶来实现[3]。如果缺乏端粒酶活性,由于DNA聚合酶不能完整复制线型的DNA末端,端粒将会在每次细胞分裂后丧失一部分5′DNA;累积的端粒缩短会造成细胞增殖速度的减慢,乃至衰老。转染端粒酶催化亚基至人正常体细胞,则其端粒长度的维持作用可使细胞保持表型的年轻状态[4]。抑癌基因突变的细胞中,若端粒酶过度激活,则可能导致肿瘤发生。现已发现约90%[5-6]人类恶性肿瘤细胞内表达端粒酶。而正常人体,除造血干细胞、生殖细胞等分裂旺盛的细胞低度表达端粒酶外,其余均为阴性[7],这使得端粒酶有可能成为广谱抗肿瘤治疗靶位[8-9]。这使得端粒酶活性调控机制成为研究热点。端粒酶激活及调节机制虽然尚未明确,但有关这方面的研究近年来不断取得了新的进展。

1 端粒酶的发现、作用及意义

端粒实质上即真核生物染色体末端的特殊结构,由一段串联重复的富G(鸟嘌呤碱基)DNA序列(TTAGGG)及相关蛋白组成。自Blackburn[10]在四膜虫(Tetrahymena)中发现了端粒具有重复序列以来,不同物种的端粒相继测定。端粒的重复长度在各物种并不相同。如人类为5～20 kb,大鼠为20～100 kb,小鼠为100～150 kb[11]。端粒一方面具有稳定染色体末端、防止染色体的异常重组、端-端融合及染色体丢失等作用,另一方面端粒长度维持在一定范围之内又是细胞有丝分裂正常进行的保证[12]。染色体DNA在沿着5′—3′,方向复制过程中,由于DNA聚合酶不能进行全长复制,导致端粒长度随着细胞有丝分裂的不断进行而逐渐缩短。利用染色体末端限制片段分析法(TRFs),显示人正常体细胞每年约丢失15～40 bp的端粒。同时,大多数正常体细胞随着其染色体端粒的不断丢失,也逐渐丧失了分裂的能力,细胞即呈现出衰老的表现,当端粒缩短超过某一临界范围时,将最终导致细胞死亡[13]。由此可见,端粒的长短和稳定与细胞的生命活动密切相关,是细胞寿命的“记时器”。端粒长度的维持是由端粒酶来完成的,端粒酶补充缺失端粒的方式是以自身的RNA亚单位作为模板,以蛋白质亚单位进行催化,通过逆转录方式完成,但在大多数正常体细胞中并不能检测到端粒酶的活性,正因为如此,才能保证细胞有丝分裂的正常进行。但在发生于不同组织部位的恶性肿瘤标本中,几乎都可以检测到端粒酶的活性。1994年Kim[14]利用端粒重复扩增法(telomeric repeat amplification proteocol TRAP)检测了18种不同肿瘤组织的100个永生细胞株,其中98个为端粒酶活性株,而同时检测的22个正常细胞株则全为阴性株。其后越来越多的证据也表明在恶性肿瘤细胞中出现了端粒酶活性的激活。Minghong等的实验证实,在20例卵巢恶性肿瘤和17例潜恶性肿瘤(LMP)中,都含有端粒酶的活性,而在24例卵巢囊腺瘤中,仅有5例有端粒酶活性。这种端粒酶与恶性肿瘤的显著相关性表明,在肿瘤细胞中,端粒酶由于某种原因重新被激活,维持了染色体末端端粒的长度,使部分肿瘤细胞逃脱衰老死亡,成为永生细胞,获得了无限增殖的能力。端粒酶在(恶性)肿瘤形成和发展过程中所发挥的关键作用,也为肿瘤的治疗提供了新的思路和努力方向。端粒酶的发现和最终确定具有重要的现实意义,它可以使人类对细胞的衰老和死亡有着更本质的了解,一旦内源或外源性的端粒酶抑制被发现或合成,将会把肿瘤的治疗推向一个新的高度。

2 细胞因子对端粒酶活性的调控

由于端粒酶在造血细胞、生殖细胞、肿瘤发生及发展中均起重要作用,对端粒酶调控机制的研究吸引着众多研究者注意。按调控作用位点的不同,分述如下。

2.1 结合于端粒的相关蛋白对端粒酶的调控

TRF美国约洛克菲勒大学Susan Smith和T.de Lange的研究小组在90年代初期[15],发现了第一个与端粒DNA特异结合的蛋白质:端粒重复结合因子(telomeric repeat binding factor-1 TRF)1和2。其中 TRF2对端粒具有保护作用,而TRF1则是端粒长度的负向调节因子[16]。在端粒酶活性的细胞株中,TRF1的过度表达会导致端粒长度的进行性缩短,这一作用是通过阻碍端粒酶与端粒的结合而发挥的,而不是通过控制端粒酶的表达。

Tankyrase在发现TRF1对端粒酶的调控作用后,研究人员推测可能存在着一种与T RF1结合的蛋白质,由它来调节TRF1的功能。这一猜想已经被Smith S et al[17]1998年的研究结果证实,并将这种蛋白质命名为端锚聚合酶(Tankyrase,T RF1-interactin,ankyrin-related ADP-ribose poly-merase)。正常情况下,TRF1结合在染色体的端粒上,使端粒酶不能对缺失的端粒进行修复,而在血细胞、肿瘤细胞及产生精子、卵子的细胞中,与 TRF1结合的 Tankyrase则可以把TRF1从端粒上移开,从而使端粒酶发挥作用。Tankyrase的发现,无疑为恶性肿瘤的治疗开辟了新的途径。如果Tankyrase的作用确实如此,那么针对 Tankyrase的抗肿瘤药物可以通过抑制Tankyrase,使端粒酶不能接近端粒,无从发挥端粒酶使获得永生的肿瘤细胞重新死亡。进一步研究发现,Tankyrase包括 TANK1和TANK2。TANK1是端粒的正向调控因子,同TRF1结合后,使TRF1糖基化不能与端粒重复序列结合,失去对端粒酶的抑制功能,因此过表达TANK1可使端粒延长[18]。TANK2(85%与Tank1同源)亦与TRF1作用,过表达TANK2导致细胞迅速死亡[19]。

hPot1 Pot1(protection of telomere)蛋白为单链结合蛋白,在T-loop的基础上与3′末端富G链结合。Pot1具有重要的端粒保护作用,去除裂殖酵母的Pot1基因立即导致其端粒序列迅速丢失,端端融合,细胞死亡,只有少数细胞通过染色体环化幸存[20]。人Pot1先前被鉴定为管家基因,其mRNA在人的所有器官中均能检测出来,利用间接的免疫荧光法确定hPot1定位于人细胞间期的端粒上[20]。hPot1基因有22个外显子,大多数在cDNA均检测出来,但有4个外显子在某些转录中出现跳跃现象,产生5种异构体,其中4种于所有细胞中均表达,第5种有白细胞特异性,5种不同的蛋白与3′末端结合能力差别极大[21]。生化分析表明,hPot1能结合在端粒的单链DNA末端的任何部位[22]。hPot1可能参与端粒酶对染色体的调控,在T-loop展开后保护 3′端粒DNA。当它与端粒末端单链结合时,端粒酶不能识别其引物,从而不能启动端粒的延长。

2.2 存在于细胞膜的端粒酶调控相关蛋白

细胞膜上存在一些与端粒酶活性共同表现的分子事件。例如,在表现端粒酶活性的人类表皮细胞亚群中,细胞共表达整合素β1(integrin betal)和表皮生长因子(EGRE),而端粒酶活性呈阴性的细胞亚群中,表达神经生长因子受体(NGFR)p75、整合素β4(integrin be-ta4)和 bcl-2蛋白[23]。又例如,在静息T细胞中,低亲和的神经生长因子能激活端粒酶,但这一过程要求TCR和CD28-B7的共同存在[24]。

3 基于hTERT亚单位的端粒酶活性调控

3.1 hTERT的结构、功能

人端粒酶复合体由3个主要的亚单位组成:端粒酶 RNA组分(hTR),端粒酶相关蛋白(TP1/TEP1)和端粒酶催化亚单位(hTERT)。hTERT编码基因由Meyerson et al[25]和Nakamura et al[26]两个研究小组于1997年分别在不同的实验室几乎同时克隆,分别命名为 hEST2和hTERT。hTERT编码的蛋白相对分子质量Mr 127 000,包含1 132个氨基酸,有7个逆转录酶的基序(motif)和1个端粒酶特异的基序,因此它归于逆转录酶家族中的一员。其基因位于5号染色体短臂的最末端(5p15.33)[27],为一单拷贝基因,长度为40 kb,目前在人类基因组中未发现其它相关基因。hTERT是端粒酶的催化亚基,与人端粒酶相关蛋白(hTEP1)结合形成复合物全酶,激活端粒酶的活性。hTERT仅表达于肿瘤及部分癌前病变组织中,而正常或肿瘤旁组织几乎全为阴性。相反,人类的端粒酶RNA亚基(human telomerase RNA,hT R)和端粒酶其它蛋白组分,如P80同源蛋白TP1的mRNA表达在两类细胞中都相对丰富[25]。hTERT基因导入原本不能或只能有限传代的原代培养细胞,如毛细血管内皮细胞[13]、淋巴管内皮细胞[28]、脐带内皮细胞[29]、肾近端小管上皮细胞[30]、肝内皮细胞[31]、直结肠隐窝细胞[32]、乳房上皮和基质细胞[33]、骨关节炎成纤维细胞样滑膜细胞[34]、牙乳头、牙髓、牙周膜、牙龈成纤维细胞[35]、包皮纤维母细胞[36]、人胚胎成纤维细胞[37]等,可诱导这些细胞永生化从而进一步建立细胞系,或明显延长其寿命[38]。而人胚神经祖细胞(hNPC)在转染hTERT后则出现恶性表型[39],如失去正常二倍体核型,接触抑制消失,不附壁也可生长,可在裸鼠体内形成神经母细胞瘤样肿瘤等。国内杨仕明等亦发现[40-43],在胃癌、肠癌及肝癌,端粒酶的三个亚单位中TP1及hTR在癌细胞内高表达,在癌旁正常组织内也有或多或少的表达;hTERT则仅在癌细胞内高表达,在癌旁正常组织内极少表达,且hTERT的表达水平与肿瘤的恶性程度成正相关。转染hTERT cDNA到端粒酶阴性的原代培养细胞内后,可检测到端粒酶表达[32-33,37,44]。这表明作为端粒酶的限速成分,hTERT在转录水平对端粒酶活性起主要调控作用。hTERT是端粒酶活性的限速亚单位,对端粒酶的活性起着决定作用。因此,对hTERT表达的调控因子,同时也间接调控着端粒酶的活性。

3.2 基于hTERT的端粒酶活性调控

就端粒酶亚单位水平面言,端粒酶的活性表达主要是通过hTERT基因的转录机制严格调控的,但hTERT基因的调节机制到目前为止所知甚少。已发发现的几个可能控调hTERT基因表达的因子有如下几个。①C-myc是hTERT转录的直接激活因子之一。近年来研究进一步表明,c-myc的过度表达可能是恶性肿瘤中端粒酶活性升高的一个重要机制。Horikawa等[45-46]研究发现在核心启动子区域和转录起始点下游各存在一个典型的E-box(CACGTG),它们是c-myc原癌基因产物潜在的结合位点,其中上游E-box可以使hTERT启动子活性显著上调,是正向调节元件,下游E-box对hTERT启动子活性影响不大。C-myc基因与Max蛋白以螺旋-环-螺旋亮氨酸锌指结构(bHLH-Zip)形成异源二聚体结合到E-box上,从而激活hTERT的转录。Mad蛋白是c-myc蛋白的拮抗物,能使Myc/Max二聚体结合转变为Mad/Max二聚体,从而降低hTERT启动子的活性。②Sp1也是结合到hTERT核心启动子GC富含位点和激活 hTERT转录的关键分子[47]。在核心启动子上有5个Sp1结合位点,每个位点的突变都将导致转录活性不同程度地降低,而当5个Sp1位点同时突变,则核心启动子的活性下降90%以上。多个Sp1位点是一种有效的顺式作用元件。因此,核心启动子5′末端的E-box和3′末端Sp1的结合对于hTERT的转录激活是非常重要的。C-myc和Sp1的协同作用能激活hTERT启动子的全部活性。③Wang等[48]发现具有启动hTERT转录的雌激素反应元件(estrogen response elements,EREs),在转录起始位点上游2 754bp,可以结合雌激素及其受体,应用此EREs序列与报告基因相连导入细胞,在应用雌激素作用后,转录活性可以提高10倍。④P53蛋白是一种与细胞周期相关的核磷酸蛋白,对肿瘤细胞的作用是抑制细胞增殖,诱导细胞分化和凋亡。P53蛋白能与 Sp1结合,抑制 Sp1与hTERT启动子结合[5]。激活 SL2细胞中hTERT启动子的活性,完全依赖于异位表达的Sp1,而P53可以取消这种激活作用;P53通过与Sp1形成P53-Sp1复合物而抑制Sp1与hTERT核心启动子区域结合,此作用需要P53全长基因序列的参与。p21与 E2F可能介导了 p53对hTERT的抑制作用[49]。⑤WT1(Wilms′tumor 1 tumor suppressor)是hTERT转录表达调控的抑制因子[50]。WT1通过特异地与Sp1竞争性地结合转录起始位点上游-281bp处的“GCGCGGGCG”序列(Sp1结合位点)而抑制hTERT的转录。⑥hTERT的核移位是其活性调节的重要机制,因为hTERT在胞质合成,但需在胞核内发挥作用。在TNF-α的刺激下,NF-κ B P65亚基与胞质中的hTERT瞬间结合,并共同移位于核内,使核内端粒酶活性明显升高[51]。⑦蛋白激酶C和Cdc42/Rac1 Yeh et al[52]发现,蛋白激酶C(protein kinase C-zeta,PKC zeta)可正向调控人鼻咽癌细胞端粒酶活性,而PKC zeta的活性由 Cdc42/Rac1正向调控,因此推测抑制Cdc42/Rac1之后,也可下调端粒酶活性。实验结果显示,采用短链反义寡苷酸序列下调Cdc42/Rac1表达水平后,端粒酶活性受到抑制。同时还发现,瞬时表达Cdc42/Rac1的无功能突变体,同样可以抑制端粒酶活性。人鼻咽癌细胞株NPC-076在PKC的抑制剂(bisindolylmaleimide I和H-7)作用下,端粒酶的活性明显下降[53]。Kim et al[54]进一步发现,PKC正向调控端粒酶活性的作用是通过hTERT实现的,PKC在这一端粒酶调控通路中可能起重要作用。⑧其它可能参与hTERT调控的因子晚近发现,孤儿受体COUPTFII能与hTERT启动子特异作用,抑制hTERT的表达[55-56]。而TEIF(transcriptional elementsinteracting factor)[57]与EWS/ETS癌蛋白[58-59]通过与hTERT启动子结合,上调hTERT mRNA,激活端粒酶活性。此外,Wang et al[60]发现,在端粒酶阴性的细胞内曲古抑菌素A抑制组蛋白去乙酰化酶后,可导致hTERT基因在染色质相应功能区的开放及hTERT的转录,这提示组蛋白去乙酰化酶可能在染色质水平负向调节hTERT的表达。Banik et al[61]发现,PinX1在体内可通过结合到已装配的hTERT/hTR复合体而抑制端粒酶活性。核因子kappaB(nuclear factor kappaB,NF-kappaB)被发现可能起激活hTERT的作用[62-63]。Zhong et al[64]发现,在成釉细胞瘤,端粒酶的活性与pRb的低表达和E2F-1的高表达有关,并在G(1)未期可被细胞周期素E上调。1,25二羟维生素D3也可下调端粒酶活性[65]。Guilleret et al[66]还发现,端粒酶阳性的细胞内CpG岛的高度甲基化是端粒酶表达的一个必要条件。新近,活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)被发现可结合到hTERT启动子区,在转录水平促进hTERT的表达[67]。

4 基于miRNA的端粒酶活性转录后调控作用

以上有关端粒酶表达调控的研究大多为转录水平的调节,未涉及转录后的调节。转录后的调节主要涉及 microRNA(即 miRNA)[68]。随着miRNA的发现及其功能的阐明,miRNA在端粒酶活性调换中的作用逐渐被发现。由于端粒酶的主要限速亚单位是hTERT,因此miRNA主要通过对hTERT的转录后调控参与端粒酶活性的调节。miRNA是一种广泛存在于真核生物细胞中、非编码的、长19-24nt的单链小分子RNA,首先在线虫中发现可时序调控胚胎发育,随后在多种动物、植物细胞中发现miRNA分子的存在,目前已有4 000多种miRNA被鉴定出来。据估计,在人类基因组中至少存在1 200条miRNA,是最大的一类基因表达转录后调控因子[69]。miRNA的广泛存在与进化保守性,提示它在生命活动中具有重要的调节作用。miRNA的基因通常成簇存在,多个miRNA基因共同转录成一个前体miRNA,并由该miRNA前体加工成多个成熟的miRNA。在表达上具有时序性和组织特异性。成熟的miRNA与Argonaute蛋白家庭成员结合形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC),该复合物与靶mRNA的3′URT结合,然后对靶mRNA进行切割或者翻译,对靶基因表达进行负向调控。miRNA调控基因表达的方式主要有三种[70]:与靶向 mRNA完全互补,通过经典的RNAi途径降解mRNA;与mRNA在部分错配的情况下实现不完全互补配对,从而抑制蛋白翻译,不过此时mRNA水平并不会降解;指导靶向基因的mRNA快速脱腺苷化,进而导致mRNA的快速衰减和表达水平的降低。miRNA对靶基因的调节并非一对一的,一条miRNA可以调控数百个靶基因的表达,而一个基因亦可同时被多个miRNA分子调控[68]。并且,极微量的miRNA即可对靶蛋白的表达产生明显的调控作用[71]。由于miRNA对包括肿瘤相关蛋白在内的多种蛋白起着关键的调节作用,其表达谱的改变,在多种肿瘤的发生发展过程中有重要作用。参与hTERT调控的miRNA在肿瘤发生发展中具有重要意义,可作为潜在的肿瘤治疗靶位[68,72]。目前有关miRNA调控hTERT表达的研究仅见一篇文献报道。Mitomo et al[73]。根据以往文献挑选了10条在甲状腺癌与相应正常组织表达有差异的miRNA,检测它们在hTERT阳性的甲状腺癌(ATC)与hTERT阴性的甲状腺癌(PTC)中的表达,发现miR-138在ATC中表达下调。进一步实验发现,在hTERT的3'UTR端,具有miR-138的结合位点;并且,上调miR-138可抑制hTERT表达,而抑制miR-138的表达,则可恢复hTERT的表达,从而确认了miR-138对hTERT具有调控作用。

5 端粒酶的应用性研究与展望

敲除端粒酶的转基因小鼠,对皮肤源性肿瘤发生具有抵抗性[74];而高表达端粒酶的转基因小鼠,与野生型小鼠相比,更易患上皮源性肿瘤[75]。端粒酶与肿瘤发生之间的密切关系,已经被大量的基因和临床研究证实。端粒酶的直接或间接抑制剂不仅可以用于肿瘤的治疗[74],而且端粒酶活性的高低还可以用来对一些临床良性表现、但具有潜在恶性变的肿瘤的发展趋势给予判断。此外,端粒酶的测定在肿瘤的检测和预后效果的估价上也有重要意义。虽然端粒酶在细胞衰老和肿瘤恶变中扮演了重要的角色,但在此过程中仍然存在很多疑问。如端粒酶究竟在肿瘤发生的哪一阶段被激活?激活的机制是什么?人体的一些细胞终生表现端粒酶的活性,端粒酶抑制剂的应用对这些细胞会产生何种影响?

[1]Baykal A,Rosen D,Zhou C,et al.Telomerase in breast cancer:a critical evaluation[J].Adv Anat Pathol,2004,11(5):262.

[2]杨仕明,房殿春,杨金亮,等.反义 hTRT转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响[J].第三军医大学学报,2001,23(9):1034.

[3]Janknecht R.On the road to immortality:hT ERT upregulation in cancer cells[J].FEBS Lett,2004,564(1-2):9.

[4]Bodnar A G,Ouellette M,Frolkis M,et al.Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells[J].Science,1998,279(5349):349.

[5]Kyo S,Inoue M.Complex regulatory mechanisms of telomerase activity in normal and cancer cells:how can we apply them for cancer therapy[J].Oncogene JT-Oncogene,2002,21(4):688.

[6]Purev E,Soprano D R,Soprano K J.Effect of all-trans retinoic acid on telomerase activity in ovarian cancer cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2004,23(2):309.

[7]Collins K,Mitchell J R.Telomerase in the human organism.Oncogene[J].2002,21(4):564.

[8]Ide T.Telomere and telomerase as targets for anti-cancer drugs[J].Nippon Rinsho,2004,62(7):1271.

[9]Parkinson EK.Telomerase as a novel and potentially selective target for cancer chemotherapy[J].Ann M ed,2003,35(7):466.

[10]Blackburn E H,Gall J G.A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in T etrahymena[J].J Mol Biol,1978,120(1):33.

[11]Makarov V L,Lejnine S,Bedoyan J,et al.Nucleosomal organization of telomere-specific chromatin in rat[J].Cell,1993,73(4):775.

[12]Kyo S,Takakura M,Kohama T,et al.Telomerase activity in human endometrium[J].Cancer Res,1997,57(4):610.

[13]Nakamura T M,Cooper J P,Cech T R.Two modes of survival of fission yeast without telomerase[J].Science,1998,282(5388):493.

[14]Kim N W,Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266(5193):2011.

[15]Pennisi E.A possible new partner for telomerase[J].Science,1998,282(5393):1395.

[16]Smith S,de Lange T.TRF1,a mammalian telomeric protein[J].Trends Genet,1997,13(1):21.

[17]Smith S,Giriat I,Schmitt A,et al.Tankyrase,a poly(ADP-ribose)polymerase at human telomeres[J].Science,1998,282(5393):1484.

[18]Smith S,de Lange T.Tankyrase promotes telomere elongation in human cells[J].Curr Biol,2000,10(20):1299.

[19]Cook B D,Dynek J N,Chang W,et al.Role for the related poly(ADP-Ribose)polymerases tankyrase 1 and 2 at human telomeres[J].Mol Cell Biol,2002,22(1):332.

[20]Baumann P,Cech T R.Pot1,the putative telomere endbinding protein in fission yeast and humans[J].Science,2001,292(5519):1171.

[21]Baumann P,Podell E,Cech T R.Human Pot1(protection of telomeres)protein:cytolocalization,gene structure,and alternative splicing[J].Mol Cell Biol,2002,22(22):8079.

[22]de Lange T.Cell biology.Telomere capping--one strand fits all[J].Science,2001,292(5519):1075.

[23]Kunimura C,Kikuchi K,Ahmed N,Shimizu A,Yasumoto S.Telomerase activity in a specific cell subset co-expressing integrinbeta1/EGFR but not p75NGFR/bcl2/integrin beta4 in normal human epithelial cells[J].Oncogene,1998,17(2):187.

[24]Hathcock K S,Weng N P,Merica R,et al.Cutting edge:antigen-dependent regulation of telomerase activity in murine T cells[J].J Immunol,1998,160(12):5702.

[25]Meyerson M,Counter C M,Eaton E N,et al.hEST2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is up-regulated in tumor cells and during immortalization[J].Cell,1997,90(4):785.

[26]Nakamura T M,Morin G B,Chapman K B,et al.Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human[J].Science,1997,277(5328):955.

[27]Shay JW,Wright WE.Implications of mapping the human telomerase gene(hT ERT)as the most distal gene on chromosome 5p[J].Neoplasia,2000,2(3):195.

[28]Nisato R E,Harrison J A,Buser R,et al.Generation and characterization of telomerase-transfected human lymphatic endothelial cells with an ex tended life span[J].Am J Pathol,2004,165(1):11.

[29]Dai X M,Li L J,Wen Y M,et al.[Studies on the transfection of umbilical endothelia with catalytic subunit of telomerase][J].Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi,2004,22(5):373.

[30]Kowolik C M,Liang S,Yu Y,et al.Cre-mediated reversible immortalization of human renal proximal tubular epithelial cells[J].Oncogene,2004,23(35):5950.

[31]Matsumura T,Takesue M,Westerman K A,et al.Establishment of an immortalized human-liver endothelial cell line with SV40T and hTERT[J].T ransplantation,2004,77(9):1357.

[32]Zhu Y L,Zhong X,Zheng S.Conditionally immortalized human colorectal crypt cell line[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2004,33(5):379.

[33]Gudjonsson T,Villadsen R,Ronnov-Jessen L,et al.Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis[J].Cell Mol Life Sci,2004,61(19-20):2523.

[34]Sun Y,Firestein G S,Wenger L,et al.Telomerase-transduced osteoarthritic fibroblast-like synoviocyte cell line[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,323(4):1287.

[35]Kamata N,Fujimoto R,Tomonari M,et al.Immortalization of human dental papilla,dental pulp,periodontal ligament cells and gingival fibroblasts by telomerase reverse transcriptase[J].J Oral Pathol Med,2004,33(7):417.

[36]Kampinga H H,Van Waarde-Verhagen M A,Van Assen-Bolt A J,et al.Reconstitution of active telomerase in primary human foreskin fibroblasts:effects on proliferative characteristics and response to ionizing radiation[J].Int J Radiat Biol,2004,80(5):377.

[37]梁光萍,杨宗城.端粒酶催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞表型及寿命的影响[J].中国临床康复,2002,(24):3672.

[38]Taylor L M,James A,Schuller C E,et al.Inactivation of p16INK4a,with retention of pRB and p53/p21cip1 function,in human MRC5 fibroblasts that overcome a telomereindependent crisis during immortalization[J].J Biol Chem,2004,279(42):43634.

[39]Wang Y,Bai Y,Li X,et al.Fetal human neural progenitors can be the target for tumor transformation[J].Neuroreport,2004,15(12):1907.

[40]Yang S M,Fang D C,Luo Y H,Lu R,Battle P D,Liu W W.Alterations of telomerase activity and terminal restriction fragment in gastric cancer and its premalignant lesions[J].J Gastroenterol Hepatol,2001,16(8):876.

[41]杨仕明,房殿春,罗元辉,等.不同病变胃粘膜端粒酶活性及其亚单位的检测[J].癌症,2001,20(1):23.

[42]房殿春,杨仕明,门荣甫.大肠癌组织端粒酶活性的检测及其意义[J].中华内科杂志,1998,(11):22.

[43]房殿春,杨仕明,刘为纹.原发性肝癌端粒酶活性的检测及临床意义[J].免疫学杂志,1997,(03):55.

[44]Shao R,Guo X.Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein:a model forthe study of in vitro angiogenesis[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,321(4):788.

[45]Horikawa I,Cable P L,Mazur S J,et al.Downstream E-box-mediated regulation of the human telomerase reverse transcriptase(hTERT)gene transcription:evidence for an endogenous mechanism of transcriptional repression[J].Mol Biol Cell,2002,13(8):2585.

[46]Ducrest A L,Szutorisz H,Lingner J,et al.Regulation of the human telomerase reverse transcriptase gene[J].Oncogene,2002,21(4):541.

[47]Takakura M,Kyo S,Kanaya T,et al.Cloning of human telomerase catalytic subunit(hTERT)gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells[J].Cancer Res,1999,59(3):551.

[48]Wang Z,Kyo S,Maida Y,et al.Tamoxifen regulates human telomerase reverse transcriptase(hTERT)gene expression differently in breast and endometrial cancer cells[J].Oncogene,2002,21(22):3517.

[49]Shats I,Milyavsky M,Tang X,et al.p53-dependent downregulation of telomerase is mediated by p21waf1[J].J Biol Chem,2004,279(49):50976.

[50]Oh S,Song Y,Yim J,Kim TK.The Wilms′tumor1 tumor suppressor gene represses transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene[J].J Biol Chem,1999,274(52):37473.

[51]Akiyama M,Hideshima T,Hayashi T,et al.Nuclear factor-kappaB p65 mediates tumor necrosis factor alpha-induced nuclear translocation of telomerase reverse transcriptase protein[J].Cancer Res,2003,63(1):18.

[52]Yeh Y M,Pan Y T,Wang T C.Cdc42/Rac1 participatesin the control of telomerase activity in human nasopharyngeal cancer cells[J].Cancer Lett,2005,218(2):207.

[53]Ku W C,Cheng A J,Wang T C.Inhibition of telomerase activity by PKC inhibitors in human nasopharyngeal cancer cells in culture[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,241(3):730.

[54]Kim Y W,Hur S Y,Kim T E,et al.Protein kinase C modulates telomerase activity in human cervical cancer cells[J].Exp Mol Med,2001,33(3):156.

[55]Wang Q,Bai Z,Li X,et al.The evidences of human orphan receptor COUP-TFII inhibiting telomerase activity through decreasing hT ERT transcription[J].Cancer Lett,2004,214(1):81.

[56]Wang Q,Bai Z L,Xuan L,et al.Inhibitory role of transcription factor COUP-TFII in expression of hTERT in HeLa cells[J].Chin Med Sci J,2004,19(3):157.

[57]Tang Z,Zhao Y,Mei F,et al.Molecular cloning and characterization of a human gene involved in transcriptional regu-lation of hTERT[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,324(4):1324.

[58]Shindoh M,Higashino F,Kohgo T.E1AF,an ets-oncogene family transcription factor[J].Cancer Lett,2004,216(1):1.

[59]Fuchs B,Inwards C,Scully S P,et al.hT ERT Is highly expressed in Ewing's sarcoma and activated by EWS-ETS oncoproteins[J].Clin Orthop Relat Res,2004,(426):64.

[60]Wang S,Zhu J.The hT ERT gene is embedded in a nuclease-resistant chromatin domain[J].J Biol Chem,2004,279(53):55401.

[61]Banik S S,Counter C M.Characterization of interactions between PinX1 and human telomerase subunits hTERT and hTR[J].J Biol Chem,2004,279(50):51745.

[62]Wang W,Luo H S,Yu B P.Expression of NF-kappaB and human telomerase reverse transcriptase in gastric cancer and precancerous lesions[J].World J Gastroenterol,2004,10(2):177.

[63]Sinha-Datta U,Horikawa I,Michishita E,et al.T ranscriptional activation of hTERT through the NF-kappaB pathway in HT LV-I-transformed cells[J].Blood,2004,104(8):2523.

[64]Zhong M,Wang J,Zhang B,et al.[Expression of pRb and E2F-1 and telomerase activity in ameloblastoma.][J].Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi,2004,39(5):406.

[65]Jiang F,Bao J,Li P,et al.Induction of ovarian cancer cell apoptosis by 1,25-dihydroxyvitamin D3 through the downregulation of telomerase[J].J Biol Chem,2004,279(51):53213.

[66]Guilleret I,Benhattar J.Unusual distribution of DNA methylation within the hTERT CpG island in tissues and cell lines[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,325(3):1037.

[67]Chebel A,Rouault J P,Urbanowicz I,et al.Transcriptional activation of hT ERT,the human telomerase reverse transcriptase,by nuclear factor of activated T cells[J].J Biol Chem,2009,284(51):35725.

[68]Petri A,Lindow M,Kauppinen S.MicroRNA silencing in primates:towards development of novel therapeutics[J].Cancer Res,2009,69(2):393.

[69]Liu N,Okamura K,Tyler D M,Phillips M D,Chung W J,Lai E C.The evolution and functional diversification of animal microRNA genes[J].Cell Res,2008,18(10):985.

[70]Banerjee D,Slack F.Control of developmental timing by small temporal RNAs:a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression[J].Bioessays,2002,24(2):119.

[71]Brodersen P,Voinnet O.Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2009,10(2):141.

[72]Garzon R,Fabbri M,Cimmino A,Calin G A,Croce C M.MicroRNA expression and function in cancer[J].Trends Mol Med,2006,12(12):580.

[73]Mitomo S,Maesawa C,Ogasawara S,et al.Downregulation of miR-138 is associated with overexpression of human telomerase reverse transcriptase protein in human anaplastic thyroid carcinoma cell lines[J].Cancer Sci,2008,99(2):280.

[74]Gonzalez-Suarez E,Samper E,Flores J M,Blasco M A.T elomerase-deficient mice with short telomeres are resistant to skin tumorigenesis[J].Nat Genet,2000,26(1):114.

[75]Gonzalez-Suarez E,Samper E,Ramirez A,et al.Increased epidermal tumors and increased skin wound healing in transgenic mice overexpressing the catalytic subunit of telomerase,mTERT,in basal keratinocytes[J].EMBO J,2001,20(11):2619.