侯风刚

血管生成拟态（vasculogenic Mimicry，VM）是近年来提出的一个肿瘤微循环的全新概念。与经典的血管生成途径完全不同，VM 是高侵袭性肿瘤为了满足自身的血液供应，通过自身表型和细胞外基质重塑而围成的一种类血管样的管道，是不依赖血管内皮细胞的一种肿瘤微循环模式，VM的发现解释了以抑制肿瘤血管生成为主要作用靶点的抗肿瘤治疗效果不佳的原因。自 1999年Maniotis 发现黑色素瘤组织中存在 VM 以来，人们开始认识到内皮细胞依赖的肿瘤血管生成并不是肿瘤唯一的微循环模式，在抑制肿瘤微循环的治疗中兼顾 VM 与血管生成，尤其重视 VM 的治疗才能获得良好疗效。尽管 VM 形成机制还尚未完全明确，但相关研究仍取得了很大进展，这对于寻找抑制 VM的关键作用靶点，筛选有效的 VM 治疗药物，提高肿瘤疗效有着重要的现实意义。现将近年来 VM 形成机制的研究做一综述。

1 肿瘤细胞的“可塑性”

Maniotis 在发现 VM 的同时，注意到高侵袭性与低侵袭性的人黑色素瘤细胞在形成 VM 的能力上存在明显差异，推测可能是两种细胞在基因表达上存在差异[1]。Seftor等[2]随后发现，高侵袭性黑色素瘤 MUM-2B 细胞可形成VM，而低侵袭性黑色素瘤 MUM-2C 细胞很难形成 VM，两者共有多达 210 个基因表达不同，MUM-2B 分子标志与多能胚胎样基因型非常相似。Hendrix 等[3]也发现高侵袭性黑色素瘤 VM 形成过程中肿瘤细胞能同时表达多种基因，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维干细胞等细胞表型的特异基因，而其本身特异的分化标记表达显著下调，说明高侵袭性黑色素瘤细胞能发生表型改变，呈现多潜能胚胎干细胞的属性。研究还发现这种肿瘤细胞在三维培养中形成 VM 管道样结构的过程与胚胎时期原始血管网的形成非常相似，而且高表达血管上皮钙黏附素（VE-cadherin，VE-cd）等胚胎时期血管发育密切相关基因，因而推测 VM 的发生“重演”了胚胎时期血管形成过程[4]。Mourad-Zeidan 等[5]发现在黑色素瘤 VM 形成过程中肿瘤细胞会发生表型重塑，可以表达 VE-cd、白细胞介素 8（interleukin-8，IL-8）、内皮分化基因 1（endothelial differentiation gene 1，EDG1）、纤维连接蛋白 1（fibronectin-1，FN-1）、基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase，MMP-2）等内皮细胞标记物，为上述的推测提供了有力的支持。目前已明确大多数肿瘤都能形成VM 的结构，而除了黑色素瘤细胞以外，其他肿瘤的肿瘤细胞也能在 VM 形成过程中出现表型的“可塑性”，如膀胱癌细胞能在三维培养下表达多种内皮相关标记因子，并形成类似血管的管网状结构，说明其具有内皮细胞的一些特征，能模拟内皮细胞形成肿瘤微循环结构[6]。最新研究表明，对能够形成 VM 结构的神经胶质瘤细胞进行细胞特性研究，发现这些细胞有某些干细胞特性，具有多向分化的能力[7]。这些研究充分表明，在 VM 形成过程中肿瘤细胞能够去分化逆转为多潜能胚胎干细胞表型，表现出很强的可塑性，这可能是 VM 形成的一个非常重要的机制。

2 肿瘤细胞微环境改变

近年来的研究表明，肿瘤细胞微环境改变在 VM 形成过程中也起着重要作用。研究发现，缺氧可以促进 VM 形成。Hendrix 等[8]认为，缺氧环境使包括高侵袭性黑素瘤细胞在内的恶性肿瘤细胞基因型发生改变，塑形性明显提高，并选择性地表达某些血管内皮相关细胞基因，使其能够作为血管内皮样的细胞参与 VM 形成。在实验中，他们将侵袭性黑色素瘤细胞植入缺血的裸鼠后腿肌肉中，5 d 后 VM生成，20 d 后随着缺血区新生血管的生成 VM 逐渐减少至消失，说明肿瘤微环境对 VM 形成确有影响。Sun 等[9]也发现黑色素瘤细胞在缺氧微环境中缺氧诱导因子 HIF-1α表达增加，并诱导 VM 管道形成以获得足够供氧。在胃腺癌和卵巢上皮癌细胞中，也有类似发现[10-11]，同时还发现，抑制缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表达，就可阻断 VM 形成[11]。这些研究表明缺氧不但可以促进恶性肿瘤 VM 的形成，而且很可能是诱发肿瘤细胞形成 VM 的一个重要始动因素。

肿瘤细胞外基质（ECM）重塑是 VM 形成过程中的一个重要改变，众多研究表明，基质金属蛋白酶（MMPs）、层黏连蛋白（LN）及其分解产物对于肿瘤细胞外基质重塑起着重要作用。在 VM 早期研究中，有学者就通过侵袭性卵巢癌 VM 基质的免疫组化分析发现[12]，基质金属蛋白酶在 VM 网络周围大量分泌，加入金属蛋白酶抑制剂可以抑制 VM 形成。LN5γ2、MMP-2 和mmP-14 对于 VM 形成是非常重要的[13]，其机制可能是肿瘤细胞过度表达 LN和基质金属蛋白酶（MMPs），同时细胞表面 LN 受体也增多，黏附更多的 LN，活化的mmP 将 LN 分裂成 2γ 和2γx 片段，沉积于细胞外，促进 VM 形成。Hendrix 等[14]在培养过转移性黑素瘤细胞的、含有丰富的 LN5γ2 链及其被mmP 分解后形成的 γ2' 链和 γ2x 链的三维基质中，加入低侵袭性的黑素瘤细胞后，低侵袭性瘤细胞也可以被诱导表达血管形成和基质重构的基因，形成血管生成拟态，提示细胞微环境中的 LN5 γ2 链及其产物 γ2' 链、γ2x 链对血管生成拟态有促进作用。在另一个实验中，将不能形成 VM的低侵袭性黑素瘤细胞置于曾经培养过高侵袭性黑素瘤细胞的基质中进行三维培养，发现低侵袭性细胞的基因表达发生了显著变化，并产生了 VM；当去除这种基质后，低侵袭性细胞则失去形成 VM 的能力[15]。这说明高侵袭性黑色素瘤细胞能产生 VM 形成所需的物质。Folberg 等[16]进一步提出高侵袭性黑色素瘤能产生 Laminin、IV 型胶原、VI型胶原和纤维结合蛋白，而这些物质构成了 VM 增殖所需的细胞外基质微环境，而细胞外基质微环境的这些变化能诱导 VM 的产生，说明肿瘤细胞外基质重塑也参与了 VM形成。所有这些研究均证实肿瘤细胞与细胞外基质之间相互作用，促进了肿瘤细胞外基质重塑，从而导致了 VM 形成，这可能是 VM 形成的另一个重要机制。因此，关于肿瘤VM 的形成，我们可以推测，一些肿瘤细胞在细胞周围环境改变如缺氧的情况下，细胞表型发生重塑，并影响细胞外基质重构，最终导致肿瘤 VM 形成。

3 VM 形成分子机制

肿瘤 VM 形成的分子机制目前尚不完全清楚，但众多研究表明，这一机制是十分复杂的，可能与多种调控因子、多种调控路径有关。

VE-cd 是一种公认的、内皮特异性的 Ca2+依赖跨膜蛋白，介导细胞与细胞相互黏附，属于钙粘素家族成员，正常情况下，由内皮细胞特异表达，集中分布在内皮细胞连接处，是胚胎时期内皮细胞发生重新排列形成管道结构的重要分子条件，大量研究表明，VE-cd 在 VM 形成过程中扮演着关键角色。近年来发现 VE-cd 是很多 VM 调控因子的靶分子，这些物质通过调控 VE-cd 而起作用。Twist1 是上皮细胞间叶样变（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的重要调控因子，对于肿瘤侵袭和转移有明确地促进作用，研究发现[17]，Twist1 上调可以上调 VE-cd 表达，从而促进肝癌细胞形成 VM。螺旋环螺旋 DNA 结合抑制因子-2（inhibitor of DNA binding 2，Id2）是 HLH 蛋白家族的重要成员之一，在多种细胞的分化与转录调控中发挥着相当复杂的作用，与肿瘤细胞增生、分化、凋亡、侵袭等密切相关。研究表明[18]，Id2 在人眼色素层黑色素瘤细胞形成 VM 的分子调控中起一定作用，这种作用也主要是通过上调VE-cd 表达来完成的。半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）即 β 半乳糖苷结合蛋白，是涉及肿瘤生长和转移的一种物质，在黑色素瘤细胞 VM 形成过程中也起着重要作用，cDNA 微阵列分析表明，Gal-3 通过调节 VE-cd 等内皮细胞标记物基因的表达，引起黑色素瘤细胞表型重塑，促进VM 形成[5]。

研究表明[3,19-20]，EphA2 在 VM 形成中也起着重要作用，是调控 VM 形成的另一个关键物质。作为VE-cd 的下游调控因子，EphA2 与 VE-cd 关系密切，并且可能影响多个信号传导通路促进 VM 形成。研究认为[21-22]，VE-cd能在相邻黑色素瘤细胞间同型结合，使上皮细胞激酶（EphA2）局限于细胞膜上，与相邻细胞膜配体 ephrin-Al相结合发生磷酸化，磷酸化的 EphA2 与 FAK 在细胞膜上相互作用，引起 FAK 磷酸化和活化，而 FAK 的磷酸化通过 MapK 通路，特别是 MEKI/2—Ekrl/2 通路，激活尿激酶活性，促进 VM 形成。在这个通路上阻断 VE-cd、EphA2、FAK 任何一点均可明显降低肿瘤细胞形成 VM 的能力。蛋白酪氨酸激酶（PTKs）与肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭等过程中信号传导蛋白的磷酸化密切相关，作为EphA2 的配体，PTKs 活化也可以导致肿瘤 VM 形成。Hess 等[23]发现，PTKs 表达在高侵袭性黑色素瘤中明显升高，其活性在 VM局部有所增加，而其受体 EphA2 也特异性地表达，抑制PTKs 活性或者敲除 EphA2 基因均可明显抑制 VM 产生，说明 PTKs 引起的信号转导蛋白磷酸化对 VM 形成非常重要，而 EphA2 作为受体与 PTKs 相互作用，参与了信号转导蛋白磷酸化的过程，最终导致 VM 形成。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号通路在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、黏附方面均起着重要调节作用，与肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等也密切相关，近年来发现 PI3K 在肿瘤 VM 形成中也起重要作用，而这种作用与其参与调控肿瘤细胞外基质重塑有关。Hess 等[24]发现在黑色素瘤细胞形成 VM 的过程中，PI3K 调节膜型-基质金属蛋白酶 1（membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP/MMP-14）的功能，MT1-MMP 在金属蛋白酶组织抑制因子-2（tissue inhibitor ofmmP-2，TIMP-2）的协同作用下活化mmP-2，活化的mmP-2 分解层黏连蛋白 5γ2链为γ2' 和 γ2x 片段，沉积于肿瘤细胞外基质中，促进VM 形成；应用 PI3K 特异性抑制剂可抑制 VM 的发生。随后的研究还发现，在肿瘤 VM 网状结构染色区中LN-5γ2 链及mmPs 高表达，应用 LN-5γ2 链反义寡核苷酸、MMP-2 或 MT1-MMP 抗体均可有效抑制 VM 发生[22]。这些表明 PI3K/MMPs/LN 是 VM 形成的一条重要的调控路径。

除了上述机制以外，近年来还发现了多种与 VM 形成有关的调控因子。研究发现，组织因子途径抑制因子 2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）的相关基因表达水平在高侵袭性黑色素瘤细胞中可明显增高，同时，将低度侵袭性黑色素瘤细胞培养在含有重组组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）的三维基质中，低侵袭性肿瘤细胞能够转换为高度侵袭性细胞并呈现出内皮细胞的表型，产生一些血管样通道；阻滞 TFPI-2 可抑制mmP-2 的活性，并能阻止上述血管样通道的形成，提示 TFPI-2 可能是侵袭性黑色素瘤 VM 形成的某种途径上的一个重要调节物[25]。另外，研究表明，COX-2 参与调节了乳腺癌 VM 的形成[26]，血管内皮生长因子（VEGF）[27]与骨肉瘤、卵巢癌 VM 形成有关，CD147（细胞外mmP诱导物）则对卵巢癌 VM 形成起调控作用[28]，而迁移诱导蛋白-7（Mig-7）则对黑色素瘤 VM 形成起重要调控作用[29-30]。最新研究还发现，用 siRNA 技术下调神经胶质瘤细胞（brain-expressed X-linked gene 2，BEX2）基因能明显抑制 VM 形成，推测 BEX2 很可能是神经胶质瘤 VM 形成的重要调控因子[31]。这些研究，虽然还不能完全阐明 VM形成的分子机制，但可以肯定的是，肿瘤 VM 的形成机制尤其是分子机制是十分复杂的，是一个多因子参与调控的、多路径发展的过程，同时，一些调控因子很可能对某些肿瘤VM 的形成起着关键调节作用，有可能成为抑制或阻断肿瘤 VM 形成的关键作用靶点。

4 展望

目前已经初步明确 VM 是某些高侵袭性肿瘤细胞与细胞以及与 ECM 间相互作用导致细胞表型和 ECM 重塑所导致的。从当前研究来看，VM 的形成很可能是一个由多种因素诱导的、多因子参与的、众多信号传导通路控制的复杂过程，很多机制还需要进一步探索。例如：这些细胞与肿瘤干细胞和胚胎干细胞之间有什么关系？这些细胞的表型变化的关键调控因子或调控路径是什么?ECM 的主要成分在重塑过程中是如何变化的，哪些是导致 ECM 重构的关键因子，又是什么原因引起这些关键的因子产生了变化？相信随着研究不断深入，这些问题都能得到很好地阐明，从而为肿瘤治疗的研究提供更好的理论支持。

[1]Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry.Am J Pathol, 1999, 155(3):739-752.

[2]Seftor EA, Meltzer PS, Kirschmann DA, et al.Molecular determinants of human uveal melanoma invasion and metastasis.Clin Exp Metastasis, 2002, 19(3):233-246.

[3]Hendrix MJ, Seftor EA, Hess AR, et al.Molecular plasticity of human melanoma cells.Oncogene, 2003, 22(20):3070-3075.

[4]Hendrix MJ, Seftor EA, Hess AR, et al.Vaculogenic mimicry and tumor-cell plasticity: lessons from melanoma.Nature Rev Cancer,2003, 3(6):411-421.

[5]Mourad-Zeidan AA, Melnikova VO, Wang H, et al.Expression profiling of Galectin-3-depleted melanoma cells reveals its major role in melanoma cell plasticity and vasculogenic mimicry.Am J Pathol,2008, 173(6):1839-1852.

[6]Fujimoto A, Onodera H, Mori A, et al.Tumour plasticity and extravascular circulation in ECV304 human bladder carcinoma cells.Anticancer Res, 2006, 26(1A):59-69.

[7]EI Hallani S, Boisselier B, Peglion F, et al.A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry.Brain, 2010, 133(Pt 4):973-982.

[8]Hendrix MJ, Seftor RE, Seftor EA, et al.Transendothelial function of human metastatic melanoma cells: role of the microenvironment in cell-fate determination.Cancer Res, 2002, 62(3):665-668.

[9]Sun B, Zhang D, Zhang S, et al.Hypoxia influences vasculogenic mimicry channel formation and tumor invasion-related protein expression in melanoma.Cancer Lett, 2007, 249(2):188-197.

[10]Li M, Gu Y, Zhang Z, et al.Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of gastric adenocarcinoma.Pathol Oncol Res, 2010, 16(2):259-266.

[11]Yao LQ, Feng YJ, Ding JX, et al.Primary study of vasculogenic mimicry induced by hypoxia in epithelial ovarian carcinoma.Chin J Obstet Gynecol, 2005, 40(10):662-665.(in Chinese)尧良清, 丰有吉, 丁景新, 等.缺氧诱导卵巢上皮性癌细胞形成拟态血管的前期研究.中华妇产科杂志, 2005, 40(10):662-665.

[12]Sood AK, Seftor EA, Fletcher MS, et al.Molecular determinants of ovarian cancer plasticity.Am J Pathol, 2001, 158(4):1279-1288.

[13]Seftor RE, Seftor EA, Koshikawa N, et al.Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.Cancer Res, 2001,61(17):6322-6327.

[14]Hendrix MJ, Seftor EA, Meltzer PS, et al.Expression and functional significance of VE-cadherin in aggressive human melanoma cells: role in vasculogenic mimicry.Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(14):8018-8023.

[15]Seftor EA, Meltzer PS, Kirschmann DA, et al.The epigenetic reprogramming of poorly aggressive melanoma cells by a metastatic microenvironment.J Cell Mol Med, 2006, 10(1):174-196.

[16]Folberg R, Arbieva Z, Moses J, et al.Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns.Am J Pathol, 2006, 169(4):1376-1389.

[17]Sun T, Zhao N, Zhao XL, et al.Expression and functional significance of Twist1 in hepatocellular carcinoma: its role in vasculogenic mimicry.Hepatology, 2010, 51(2):545-556.

[18]Su F, Li B, Wang J, et al.Molecular regulation of vasculogenic mimicry in human uveal melanoma cells: role of helix-loop-helix Id2(inhibitor of DNA binding 2).Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2009, 247(3):411-419.

[19]Chen LX, Sun BC, Zhang SW, et al.The mechanisms of microenvironments influence on vasculogenic mimicry between introcular and subcutaneous melanoma.Chin J Ophthalmology, 2009,45(7):641-646.(in Chinese)陈陆霞, 孙保存, 张诗武, 等.鼠黑色素瘤眼内与皮下种植后血管生成拟态及其分子机制研究.中华眼科杂志, 2009, 45(7):641-646.

[20]Margaryan NV, Strizzi L, Abbott DE, et al.EphA2 as a promoter of melanoma tumorigenicity.Cancer Biol Ther, 2009, 8(3):281-287.

[21]Hess AR, Seftor EA, Gruman LM, et al.VE-cadherin regulates EphA2 in aggressive melanoma cells through a novel signaling pathway:implications for vasculogenic mimicry.Cancer Biol Ther, 2006, 5(2):228-233.

[22]Hess AR, Hendrix MJ.Focal adhesion kinase signaling and the aggressive melanoma phenotype.Cell Cycle, 2006, 5(5):478-480.

[23]Hess AR, Seftor EA, Gardner LM, et al.Molecular regulation of tumor cell vasculogenic mimicry by tyrosine phosphorylation: role of epithelial cell kinase (Eck/EphA2).Cancer Res, 2001, 61(8):3250-3255.

[24]Hess AR, Seftor EA, Seftor RE, et al.Phosphoinositide 3-kinase regulates membrane Type 1-matrix metalloproteinase (MMP) andmmP-2 activity during melanoma cell vasculogenic mimicry.Cancer Res, 2003, 63(16):4757-4762.

[25]Ruf W, Seftor EA, Petrovan RJ, et al.Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry.Cancer Res, 2003, 63(17):5381-5389.

[26]Basu GD, Liang WS, Stephan DA, et al.A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells.Breast Cancer Res, 2006, 8(6):R69.

[27]Mei J, Gao Y, Zhang L, et al.VEGF-siRNA silencing induces apoptosis, inhibits proliferation and suppresses vasculogenic mimicry in osteosarcoma in vitro.Exp Oncol, 2008, 30(1):29-34.

[28]Millimaggi D, Mari M, D' Ascenzo S, et al.Vasculogenic mimicry of human ovarian cancer cells: role of CD147.Int J Oncol, 2009, 35(6):1423-1428.

[29]Robertson GP.Mig-7 linked to vasculogenic mimicry.Am J Pathol,2007, 170(5):1454-1456.

[30]Petty AP, Garman KL, Winn VD, et al.Overexpression of carcinoma and embryonic cytotrophoblast cell-specific Mig-7 induces invasion and vessel-like structure formation.Am J Pathol, 2007, 170(5):1763-1780.

[31]Le Mercier M, Fortin S, Mathieu V, et al.Galectin 1 proangiogenic and promigratory effects in the Hs683 oligodendroglioma model are partly mediated through the control of BEX2 expression.Neoplasia,2009, 11(5):485-496.