贾永蕊

流式细胞术，即利用流式细胞计对处在快速直线流动状态中的单细胞活生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术，是20世纪70年代发展起来的一项技术，综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各学科的知识，它是一种自动分析的技术。随着流式细胞术的不断发展和完善，应用领域也从细胞生物学基础研究扩大到肿瘤学、血液学、免疫学、药物学、临床检验等各方面[1]。

目前，DNA分析在临床和基础研究的各个学科中应用非常广泛，通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解细胞的增殖能力，还可以通过DNA的倍体分析，判断肿瘤细胞的异质性，给临床的诊断和疗效判断提供重要的佐证[2]。另外，细胞凋亡晚期标志性的事件是染色体DNA断裂，产生的DNA片段在流式细胞仪检测时得到相应的亚二倍体峰（Sub G1峰）。

1 流式细胞仪工作原理

1.1 流式细胞仪的主要结构

流式细胞仪主要包括三大部分：（1）流动室和液流系统(Fluidics system) ;（2）光学系统(Optics system); （3）电子系统(electronics system)。如图1－1所示。

1.2 流式细胞仪的检测信号

当液流中的细胞或颗粒通过测量区，经激光照射后，当液流中的细胞在激光照射激发下，就会向各方向发射散射光和荧光（见图1-2），通过放在各方向上的光敏元件，就可得到每个细胞的一组相关参数[3]。

图1 －1 流式细胞仪结构示意图

图1-2 细胞经激光激发后产生的散射光和荧光

散射光信号分为前向角散射光（Forward Scatter, FSC）和侧向散射光（Side Scatter，SSC），散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数，即反映细胞的大小和内部结构。

激光束与细胞正相交时，产生两种荧光信号，一种是细胞自发荧光，另一种荧光信号是对细胞进行染色的特异性荧光。染料受激光照射后发射的。某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线——即荧光。特异性荧光探针与单克隆抗体相结合后，与细胞膜或胞内的靶抗原相结合，通过检测荧光素的信号强弱就可以了解抗原表达量的多少（见图1-3）。

图1 -3

2 流式细胞术在DNA分析中的应用

2.1 检测细胞周期

流式细胞术最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。通过DNA的分析可以了解细胞群体中各个周期的比率，可以知道目的细胞的生长增殖状态。细胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代继续复制并分裂，这个过程称之为细胞周期。在细胞周期中最具特征性的阶段是在分裂前的DNA含量增加并达到2倍量的时候，并在此时细胞开始分裂其自身-有丝分裂期。细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示：S期（合成期）和M期（有丝分裂期）。有丝分裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙，同样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝分裂开始之时。这两个间隙我们将之命名为G1和G2期。这样整个细胞周期可划分为G1 → S → G2 →M → G1，如图（2-1）所示：

图2-1 细胞周期在流式细胞仪上分析时的图谱特征

下面是研究Hela细胞在40μg/ml蒙古黄芪凝集素作用24 h后，流式细胞仪检测细胞周期的变化，从而可以了解药物的抗癌效果和作用机理[4]。

图2-3 蒙古黄芪凝集素对Hela细胞周期的影响

2.2 分析DNA倍体

DNA分析还可以了解细胞群体的倍体，某些恶性肿瘤细胞中会含有异倍体、多倍体、亚二倍体细胞，通过倍体分析也可以为肿瘤诊断提供一个佐证。DNA倍体的判定是根据DNA指数（DNA Index,DI）确定的，即所测细胞群的G0/G1期DNA含量与正常二倍体标准细胞G0/G1期DNA含量的比值。以正常二倍体细胞G0/G1期细胞的DNA含量定为2C值DI＝1，因为仪器本身和样本制备过程中存在的种种误差，一般认为标准二倍体细胞的CV应该在5%以下，DNA含量在2C±2CV范围内，认为是二倍体[5]。

（1）DI＝1.0±0.01 （0.90～1.10）为二倍体

（2）DI＝1.0±0.15（0.85～1.15）为近二倍体

（3）DI＝2.0±0.1（1.90～2.10）为四倍体

（4）DI＞2.10 为多倍体

这些检测是基于对细胞内DNA以化学定量方式的染色（染料着色数量直接与细胞内DNA含量相关）。

正常细胞具有较恒定的DNA含量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常是很常见的。这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式表现出来，这一指数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。

应该注意的是，只有在染色体数目的变化带来的DNA含量差异可被检测时，才可能有DNA异倍体的检出。因此DNA含量的正常不能除外恶性或染色体异常的存在。另外，正常细胞在衰老过程中的多倍体化以及肿瘤治疗后导致的DNA含量的增加、凋亡和坏死导致的DNA含量降低都是在分析DNA直方图时需要考虑的因素。

图2-4 结肠癌患者组织DNA四倍体细胞的直方图，DI为2.03

2.3 检测细胞凋亡

图2-5 VP16治疗后IM9细胞的凋亡

细胞凋亡的后期事件之一是染色体DNA的断裂，即是在核小体的位置进行切割，故而在细胞内出现成200 bp及200整数倍长度的DNA片断，这些断裂的DNA片段会渗透到细胞膜外，用PI标记DNA，通过流式细胞仪可以检测到亚二倍体峰（Sub G1峰），主要就是由上述的DNA产生的，从而可以了解凋亡细胞的含量。

20 mM的VP16作用于IM9细胞，碘化丙啶（PI）染色后，用流式细胞仪检测不同时间点，IM9细胞的凋亡情况。与0 h（未处理的细胞）相比，VP16作用12 h和24 h后没有明显的凋亡，作用36 h凋亡率为11.23%。

[1]宋平根. 流式细胞术的原理与应用[M].北京：北京师范大学出版社，1992:7.

[2]王建中. 临床流式细胞分析[M].上海：上海科学技术出版社，2005:459.

[3]吴后男. 流式细胞术原理与应用教程[M]. 北京：北京大学医学出版社，2008:17.

[4]Qiaojuan Yan，Yanxia Li，Zhengqiang Jiang，etc. Antiproliferation and apoptosis of human tumor cell lines by a lectin (AMML) of Astragalus mongholicus[J]. Phytomedicine. 2009,16: 586-593.

[5]王书奎. 实用流式细胞术彩色图谱[M]. 上海： 第二军医大学出版社，2004:121.