郝丽妮 ,赵砚彬 ,彭 辉 ,黄 崇 ,陈树林 ,胡建英 * (.西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨凌700；.北京大学城市与环境学院,北京 0087)

环境雌激素类物质(EES)能够模拟鱼体内激素的作用模式,干扰鱼类内分泌系统的正常功能,从而影响鱼类的性腺分化,导致多种鱼雌雄同体现象发生[1-3].EES的一种重要的作用模式是通过与雌激素受体(ER)结合,调控生长发育相关基因的表达[4].其中雌激素受体(ER)介导的化学物质如 17β-雌二醇(E2)、雌酮(E1)、雌三醇(E3)、17α-炔雌醇(EE2)等天然和人工合成的ER均能在实验室暴露中诱导模式鱼类如青鳉鱼雌雄同体的发生[5-6].然而在野外调查中发现,许多鱼类在低于实验室暴露浓度的条件下就发生雌雄同体现象,其中可能的的原因有:(1)实际环境中的暴露是多物质多途径的暴露过程;(2)实验动物和野生鱼类对污染物的敏感性不同[7].

关于 ER物种敏感性差异的问题,已有较多研究[7-13].Matthews等[8]研究发现双酚A、t-辛基酚(OP)及o, p-DDT与虹鳟ERα的结合能力约比人和老鼠ERα受体高10倍,Hiroshi等[9]发现壬基酚(NP)、OP与鳉(Mummichog)的ERα结合活性是人的50倍.基于这些研究背景,最近 OECD正考虑将不同鱼类 ERs的体外试验方法列入内分泌干扰物质的环境管理和风险评价中[14].梭鱼(So-iuy mullet,Mugil soiuy)是沿海地区一种重要的经济鱼类,对我国辽东湾野生梭鱼的性腺切片观察统计发现其雌雄同体的发生率高达54.5%,远高于其他调查鱼种[15].因此有必要建立梭鱼ER物种特异性的体外测试方法,从ER物种敏感性差异的角度对辽东湾梭鱼雌雄同体现象高发的成因进行解析.

酵母双杂交技术是一套采用报告基因来检测蛋白质间相互作用的技术[16].与哺乳动物细胞试验相比,酵母细胞培养成本低,稳定性好,是OECD推荐使用的一种比较理想的高通量环境污染物初筛工程菌[14].因此本研究通过克隆梭鱼 ERα(sERα),建立了 sERα活性物质物种特异性的酵母双杂交筛选方法.并在此酵母系统中比较了4种环境中普遍存在的典型雌激素活性物质(E1,E2,E3和 EE2)对 sERα和青鳉鱼ERα(mERα)诱导活性的差异, 以期从雌激素受体物种敏感性差异的角度探讨梭鱼雌雄同体发生率高的原因.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用梭鱼为辽东湾野生梭鱼;Y190酵母菌株、pGAD424-TIF2质粒、改造多克隆位点的pGBT9 质粒(EcoR I, Sac I, Bam I, Nde I, Hind Ⅲ,Cla I, Not I, Pst I)、青鳉鱼 ERα-TIF2 酵母由日本Gifu Pharmaceutical大学 Tsuyoshi Nakanishi 教授惠赠;雌激素E1、E2、E3、EE2均购买于日本东京化成,测试前用二甲基亚砜(DMSO,ACS级,AMRESCO)配成100mmol/L储备液备用.

1.2 梭鱼ERα DEF片段的分子克隆

1.2.1 梭鱼 ERα基因 cDNA部分片段的克隆快速分离梭鱼肝脏组织,利用 Trizol法提取梭鱼肝脏总 RNA.以所提总 RNA为模板,oligo(dT)15为逆转录引物,使用 MMLV(INVOTROGEN)反转录酶,反转录得到梭鱼 cDNA.根据与梭鱼在形态学分类上相近的其他鱼种的己知ERα基因序列,在 ERα 基因 DBD(DNA-binding domain)区和LBD(Ligand-binding domain)区分别选择氨基酸保守区设计简并引物 sER1,sER1′及 sER2,sER2′(引物序列见表 1).以反转录的cDNA 为模板,使用 KOD PLUS高保真DNA聚合酶(TOYOBO),用 sER1,sER1′引物进行 PCR 扩增,反应条件为:94℃ 2min,然后94℃ 15s、53℃30s,68℃ 1min进行35个循环,反应体积为 50μL.以上述PCR产物为模板,sER2,sER2′为引物,再次进行 PCR扩增,反应条件同上,退火温度变为58°C.用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,切胶回收、纯化约820bp的片段,测序.

表1 梭鱼ERα基因扩增及测序引物Table 1 PCR and sequencing primers for cloning of So-iuy mullet sequences

1.2.2 梭鱼ERα基因3′端cDNA扩增 在己测序的梭鱼ERα基因序列中设计2个3′-RACE上游引物 sER3-1和sER3-2,下游引物记为SER3′由试剂盒提供(3′-Full RACE Core Set, Takara ).首先以加接头的oligodT-3′为引物反转录梭鱼总RNA,并以转录出的cDNA为模板,sER3-1,sER3′为引物进行第一轮PCR,接着以第一轮PCR的产物为模板,sER3-2、sER3′为引物,进行第二轮扩增,两轮PCR反应的条件均为:94°C 2min,然后94°C 15 s,55°C 30 s,68°C 2min循环35次.1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,切胶回收约840bp的片段,测序.

1.2.3 梭鱼ERα基因DEF片段扩增 根据己测序的梭鱼ERα基因的序列,设计引物sER4, sER4′及加接头引物 sER5,sER5′.用两对引物依次进行PCR扩增,反应条件为:94°C 2min,然后94°C 15 s,退火温度(第一轮 53°C,第二轮 62°C) 30 s,68°C 1.5 min做35个循环,PCR纯化试剂盒(碧云天生物试剂公司)纯化第二轮扩增出的片段,得到约1100bp的梭鱼ERα基因 DEF片段.用EcoR I和Cla I内切酶(NEB)在37°C下双酶切5h后,纯化得到带黏性末端的梭鱼ERα基因DEF片段.

1.2.4 PCR产物的鉴定及序列分析 需要测序的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,纯化后,连接到平端载体上(pEASY-Blunt Cloning Vector,全式金生物技术公司)并转化 Trans1-T1感受态细胞, 用涂有X-GAL、IPTG的氨苄抗性平板筛选阳性克隆.选取 10个菌落,扩增接入片段时所对应用的引物,HSTMTaq DNA聚合酶(东盛生物)进行菌落PCR扩增(反应条件为:首先预变性 94°C 10min,然后94°C 30s, 55°C 30s,72°C 1min(扩增时间按 900～1000bp/min 算)循环45次,最后72°C延伸10min),进一步鉴定阳性克隆,并选3个克隆提取质粒测序.

1.3 pGBT9-sERα DEF和pGAD424-TIF2双杂交酵母的构建

1.3.1 pGBT9-sERα DEF诱饵质粒的构建 首先,用EcoR I和Cla I内切酶双酶切pGBT9 载体(37°C,反应 5h),酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后,切胶回收(胶回收试剂盒, Promega公司)约5500bp的片段,并连接(T4 DNA连接酶,NEB )此回收产物与 sERα-DEF片段,载体片段比例约为0.03pmol:0.3pmol,25°C 反应 15min.最后用10μL连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5α,测序鉴定.

1.3.2 pGAD424-TIF2靶质粒的鉴定 用 1μL靶质粒 pGAD424-TIF2转化感受态大肠 DH5α,筛选阳性克隆,并用P3、P3′引物测序鉴定.

1.3.3 双质粒依次转染酵母Y190细胞Y190酵母感受态细胞的制备及转染方法参考 Clontech PT3024-1酵母操作手册.首先用pGBT9-sERα质粒转化 Y190酵母感受态细胞,取 200μL转化溶液涂布于色氨酸缺陷(SD/-Trp)选择平板上,于30°C培养2～3天待长出菌落后PCR鉴定转化菌株[17].从平板上挑取1～8号克隆至SD/-Trp液体培养基中,于 30°C,250r/min 培养 16～18h 后,取1mL 菌液,以12000r/min离心1min弃上清,并在沉淀中加入20μL含2.5mg/mL溶菌酶的Z buffer溶液,震荡混匀,37°C静置反应 5min;取其中2μL做模板,以S5,S5′为引物,PCR 反应条件:预变性94°C 10min;然 后94°C 30s,55°C 30 s,72°C 1.5min做 50个循环,最后72℃延伸 10min.扩增得到长约1100bp片段的克隆,记为S1.

同上制备S1酵母感受态细胞,将pGAD424-TIF2质粒转入S1细胞中,转染液涂布于色氨酸、亮氨酸双陷平板(以下简称为SD/-Trp-Leu)上,30°C 培养 2～3d 后,用 P2,P2′引物做 PCR 鉴定阳性克隆.

1.4 酵母双杂交测试方法

具体操作按照文献报道的方法进行[18]. EC50值用Graphpad Prism 4.0软件计算.

2 结果与讨论

2.1 梭鱼ERα的分子克隆及鉴定

利用RT-PCR和RACE 技术,PCR扩增得到1113bp的基因片段,测序结果在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上比对,证明所扩片段是梭鱼的ERα基因片段(图1).采用Krust等[19]的划分方法,所扩梭鱼ERα基因片段可划分为DEF区.氨基酸序列同源比对结果表明,梭鱼ERα的DEF区与鲻鱼,青鳉鱼,人的同源性分别为92%,79%,50%.其中E/F区与青鳉鱼的同源性为82%(人为56%),D区与青鳉鱼的同源性仅为72% (人为36%)(图2),说明序列上的差异可能导致梭鱼、青鳉鱼和人ERα功能的差异.

图1 梭鱼ERα DEF区 cDNA序列与对应的氨基酸Fig.1 Nucleotide sequence of So-iuy mullet estrogen receptor DEF fragments and the deduced amino acid sequence

2.2 sERα-TIF2双杂交酵母的构建及诱导活性测试

酵母双杂交系统已广泛应用于内分泌干扰物质的受体结合活性测试[14],目前在关于受体LBD区的划分上仍然存在分歧,如将D区、E区和部分F 区划入受体的LBD区[8],或者只将E区划入LBD区[19].本研究中,首先仅将E/F区片段接入sERα-TIF2酵母系统,测试发现阳性对照物E2对此酵母并没有诱导活性,而改将DEF区接入酵母后,用E2测试具有良好的剂量-效应关系.所以本实验中所构建的sERα-TIF2酵母插入的是梭鱼ER的DEF区,关且通过测试所购建的酵母可以用于环境样品的筛选.

2.3 梭鱼和青鳉鱼ERα介导的雌激素活性比较研究

用E1、E2、E3、EE2分别暴露sERα-TIF2和青鳉鱼-TIF2(mERα-TIF2)双杂交酵母,测试 4种雌激素活性物质对两种酵母β-半乳糖苷酶的诱导活性,剂量-效应关系如图3所示.

sERα与4种物质结合的EC50分别为3.7,2.4,1.2,1699nmol/L(表2).其中EE2的相对雌激素活性(RBA)最高,为E2的2倍,E1和E3分别为E2的0.66,0.0014倍. mERα与4种物质结合的EC50分别为17,5.7,5858,4.0nmol/L(表2),与sERα相比这4种目标物质同mERα的结合活性相对较低,分别是梭鱼EC50的4.6,2.3,3.4,3.3倍.这表明与青鳉鱼相比,梭鱼ERα与某些雌激素活性物质可能具有更高的结合活性,所以sERα敏感性是使梭鱼在青鳉鱼不能发生雌雄同体的野外暴露浓度下,雌雄同体高发生的可能原因之一.

图2 梭鱼、鲻鱼、青鳉鱼、人ERα 基因 DEF区氨基酸序列同源比对分析Fig.2 Comparison of So-iuy mullet ERα DEF amino acid sequence with flathead mullet, medaka and human

图3 酵母系统中梭鱼和青鳉鱼ERα介导的雌激素活性比较(n=3)Fig.3 Comparison of ERα-mediated estrogenic binding activity between So-iuy mullet and medaka in yeast(n=3)

表2 4种雌激素的梭鱼、青鳉鱼ERα诱导活性的比较Table2 Comparison of estrogenic activities of four estrogens mediated by sERα and mERα in yeast two-hybrid system

为研究mERα与sERα结合活性的差异,本文在构建双杂交酵母时使用的是人的TIF2共激活因子[18,20],此系统可以在一定程度上反映不同雌激素活性物质与mERα和sERα结合活性的差异.但生物体本身是一个复杂的系统,体内 ER的转录激活功能需要多种共激活因子的参与[18],所以为模拟鱼类体内的真实环境,需要进一步采用鱼类细胞报告基因测试方法、原代细胞培养甚至活体暴露等方法,最终证明 ER物种敏感性与梭鱼雌雄同体高发率的关系.本酵母双杂交体系中几种典型雌激素物质与sERα和mERα结合活性差异性结果为深化该研究提供了基础数据.

3 结语

通过构建梭鱼ERα酵母双杂交筛选系统,证明了E1、E2、E3、EE2和梭鱼ERα的结合活性均高于青鳉鱼ERα,这一结果为探索辽东湾野生梭鱼雌雄同体高发生率的原因提供了重要的信息.

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致谢：感谢 Tsuyoshi Nakanishi 教授惠赠 Y190酵母菌珠,pGAD424-TIF2质粒和pGBT9质粒.