汪永红，吴刚珂

(荆州市中心医院检验科，湖北 荆州 434020)

颜承农

(长江大学化学与环境工程学院；长江大学工程技术学院，湖北 荆州 434023)

茜素紫与牛血清白蛋白相互作用特征研究

汪永红，吴刚珂

(荆州市中心医院检验科，湖北 荆州 434020)

颜承农

(长江大学化学与环境工程学院；长江大学工程技术学院，湖北 荆州 434023)

在不同温度下，用荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱和紫外可见吸收光谱法研究了茜素紫(Alizarin-Violet,ALV)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)相互作用特征。分别用Stern-Volmer方程、Lineweaver-Burk双倒数方程和热力学方程等处理试验数据，得到相互作用常数的平均值为1.078×105L/mol，相互作用的ΔHθ、ΔGθ和ΔSθ的平均值分别为-8.030kJ/mol、-29.19kJ/mol和69.80J/K，作用位置为2.38nm，作用位点数为1.173。证实了在试验浓度和温度范围内，ALV与BSA可相互作用形成具有一定结构的复合物，其荧光猝灭作用更符合静态猝灭作用特征，为研究ALV的生态环境效应、生物学效应和对蛋白质构象的影响以及ALV的染色机理等提供了重要信息。

茜素紫；牛血清白蛋白；荧光猝灭光谱；三维荧光光谱；吸收光谱；热力学参数

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，它能与许多内源性和外源性物质相互作用。研究小分子和血清白蛋白相互作用的热力学特征，可以在分子水平上认识它们相互作用的作用力性质和作用机理，从而为生命科学及药物的研究提供有用的信息。小分子染料可以与蛋白质结合，引起染料或蛋白质光谱特性的变化，因此小分子染料作为测定蛋白质的荧光探针得到了广泛应用[1,2]。茜素紫(Alizarin-Violet，ALV)是一种常用的有机显色剂，常用于食品中微量锡的光谱分析和羟自由基的光度分析[3,4]。在生产和应用ALV时，流散于水土中的ALV有可能通过食物链进入生物体内，对生态环境和生物体产生一定的影响。笔者在模拟人体生理条件下，用荧光光谱、荧光猝灭光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱和紫外-可见吸收光谱法研究了ALV与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)相互作用的光谱行为。

1 试验部分

1.1仪器与试剂

1)仪器 LS-55型荧光分光光度计(美国PE公司)；TU-1901型可见分光光度计(上海普析通用仪器有限责任公司)；AY120电子天平(日本岛津公司)；恒温水浴SYC-15型(南京桑力电子设备厂)。

2)试剂 ALV (上海试剂三厂提供，分子式C20H12O7，分子量为364.3)储备液：5.490×10-5mol/L；BSA(上海生物化学制剂厂)溶液：1.0×10-5mol/L；NaCl溶液：0.5mol/L；Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.40)。所用试剂均为分析纯，试验用水为二次去离子水，经检测无荧光杂质。

1.2试验方法

在10ml比色管中依次加入2.0ml(0.5mol/L)NaCl溶液、2.0ml Tris-HCL缓冲溶液(pH=7.40)、 2.0ml BSA溶液及一定量的ALV溶液，以二次去离子水定容为10.0ml，在λex=285nm以及狭缝宽度为15∶2.5时，在250～480nm范围内扫描BSA的荧光光谱及BSA在ALV作用下的荧光猝灭光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1ALV作用BSA的荧光猝灭光谱

曲线1～8：cALV = 0、2.745×10-6、5.490×10- 6、8.235×10-6、1.098×10-5、1.372×10- 5、1.647×10-5、1.921×10- 5mol/L；cBSA=2.0×10-6mol/L；cNaCl=0.1 mol/L。图1 BSA的荧光光谱和AVL对BSA作用的荧光猝灭光谱

1)荧光猝灭光谱 BSA是内源性荧光物质，分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基能够发射荧光。

当激发光波长为285nm时，BSA荧光发射峰位置在347nm附近。按试验方法分别扫描了25、31、37、43℃等温度下BSA和BSA-ALV体系的荧光猝灭光谱，25℃的BSA的荧光光谱和在ALV作用下BSA的荧光猝灭光谱见图1。由图1可以看出，随着ALV浓度的增大，BSA的荧光强度依次有规律的降低，表明ALV对BSA具有明显的作用。

2)荧光猝灭作用性质的描述和判断 荧光猝灭作用可分为动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移猝灭等。在一般情况下，动态猝灭作用和静态猝灭作用主要以其猝灭常数随温度的变化关系加以区分。对于动态猝灭作用，升高温度将增加分子间的有效碰撞并加剧电子的转移过程，荧光猝灭常数随着温度的升高而增大；对于静态猝灭作用，升高温度将降低复合物的稳定性，荧光猝灭常数随着温度的升高而减小。动态猝灭和静态猝灭作用还可以分别用Stern-Volmer[2]:

(1)

和Lineweaver-Burk方程[3]:

(2)

2.2线性回归方程和热力学参数

图2 Stern-Volmer 曲线和Lineweaver-Burk曲线

温度/℃Stern⁃Volmer方 程RLineweaver⁃Burk方 程R18I0F/IF=08098+1961×105cALV09935(I0F-IF)-1×10-3=5200×10-3+4263×10-8c-1ALV0999924I0F/IF=07707+2015×105cALV09917(I0F-IF)-1×10-3=5400×10-3+4710×10-8c-1ALV0999530I0F/IF=07962+1843×105cALV09919(I0F-IF)-1×10-3=5602×10-3+5201×10-8c-1ALV0999836I0F/IF=07990+1745×105cALV09894(I0F-IF)-1×10-3=6160×10-3+6116×10-8c-1ALV0999742I0F/IF=08039+1759×105cALV09917(I0F-IF)-1×10-3=6601×10-3+6521×10-8c-1ALV09999

图3 lnKLB ～1/T图

2.3ALV与BSA之间的作用力

根据反应前后热力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小，可以判断小分子与生物大分子之间的主要作用力类型[7]：ΔHgt;0、ΔSgt;0为疏水作用力；ΔSlt;0、ΔHlt;0为氢键和范德华力；ΔHlt; 0、ΔSgt;0为静电引力。当温度变化不大时，ALV与BSA作用的焓变ΔH可看成一个常数，当溶液比较稀时，KSV可视为相互作用的标准平衡常数[8]，根据式(1)和式(2)可以求得相互作用的KSV、Kq和KLB，由Van’t Hoff等压方程[8]的不定积分式：

lnK=-(ΔH/R) ·(1/T)+A

作图(见图3)可以求得ΔH，由方程[9]：

ΔGθ=-RTlnKθΔG=ΔH-T·ΔS

可求ΔGθ和ΔSθ等，见表2。由表2所列参数可以确定，ALV与BSA之间的作用力可能主要是静电作用力。由于ALV分子中含有一个羧酸基，显负电性，BSA分子中氨基酸残基均带一定量的正电荷，容易依靠静电力相互作用生成ALV-BSA复合物。温度升高可使静电作用力减小，ALV-BSA复合物的稳定性降低，静态猝灭作用常数减小，与试验结果相符。

表2 结合常数和热力学参数

2.4作用位点数和作用距离

在静态猝灭作用中，生物大分子与小分子之间相互作用的位点数n[10]可用：

化学作用必然伴随能量变化或者能量转移现象，通过能量转移效率的研究可以得到很多重要信息，如可以测定大分子中某些基团之间的距离等。根据偶极-偶极非辐射能量转移理论，当给能体分子本身能发射荧光，且其荧光发射光谱与受能体的紫外-可见吸收光谱有相当程度的重叠，给能体与受能体之间的距离靠近约在7nm以内，即有可能发生能量转移现象。能量转移效率是发生能量转移的2个基团之间距离的函数[11]:

其中，E为能量转移效率；r为供能体和受能体之间的结合距离；R0为临界能量转移距离；K为生物大分子与小分子之间相互作用的结合常数；φ为供能体荧光量子产率；J为供能体的荧光发射光谱与受能体吸收光谱的重叠积分[9,10]。试验测得BSA的荧光发射光谱和ALV的紫外-可见吸收光谱有较大程度的重叠，如图5所示。由函数关系式求得BSA与ALV之间的结合距离约为2.38nm。

曲线1:cBSA= 2.0×10-6mol/L曲线2:cALV=2.0×10-6mol/L 图图5 BSA的荧光发射光谱(1)和关系曲线ALV的紫外吸收光谱(2)

2.5ALV对BSA构象的影响

同步荧光光谱、三维荧光光谱的技术和方法在研究微环境变化对蛋白质的构象和生物活性影响方面有着广阔的前景[11]。在波长差Δλ= 15nm时的同步荧光光谱主要反映酪氨酸残基(Trp)的荧光光谱特征，波长差Δλ= 60nm时则主要反映色氨酸残基(Try)的荧光光谱特征[12]。因蛋白质中氨基酸残基的相对荧光强度及其峰波长的变化与其所处环境的改变密切相关，故由相对荧光强度及其峰波长的变化可判断蛋白质分子所处微环境的变化。固定BSA浓度，改变ALV浓度，在Δλ分别为15nm和60nm时，扫描BSA和BSA-ALV体系的同步荧光光谱(见图6)。由图6可以看出，BSA中Trp和Try残基的荧光强度随着ALV浓度增大相应减弱；Trp的荧光光谱峰波长几乎没有发生位移，由283.6nm移至284.2nm，表明在试验条件下ALV改变了Try残基所处微环境，使其极性有所增加，疏水性减小。

曲线1～8：cALV/10-6mol·L-1：0，2.745，5.490，8.235，1.098，1.372，1.647，1.921；cBSA=2.0×10-6mol/L；cNaCl=0.1mol/L。图6 BSA和BSA-ACET体系的同步图谱

按照试验方法扫描了BSA和BSA-ALV体系的三维荧光光谱(见图7)，绘制了等荧光强度图(见图8)。由图7、图8，可比较ALV作用BSA前后三维荧光光谱的变化，探讨ALV对BSA构象和微环境的影响。

由图7和图8可知，当BSA的浓度为5.0 ×10-6mol/L时，有2个荧光峰，峰1、峰2的峰顶荧光强度和峰顶坐标(IF；λex/λem)分别为(151.8；280.0/350.0)和(158.8；230.0/350.0)，当加入ALV后，峰1、峰2的峰顶荧光强度和峰顶坐标(IF；λex/λem)分别为(59.52；280.0/351.5)和(72.94；225.0/355.0)，荧光强度分别降低了92.28和85.86，峰1的激发波长基本未变，发射波长红移了1.5nm，峰2的激发波长蓝移了5nm，发射波长红移了5nm。说明ALV与BSA作用后，Trp所处微环境的极性有所增强，疏水性减小，BSA的肽链可能不同程度地伸展，构成α-螺旋结构的氢键断裂后实现氢键的重组，α-螺旋结构部分或者大部转变为β-折叠结构，形成了一种新的无序结构[13,14]。

图7 BSA和BSA-ALV体系的三维荧光光谱

图8 BSA和BSA-ALV体系的等荧光强度图

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[编辑] 洪云飞

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1673-1409(2009)04-N025-05