吴剑秋， 张莉莉， 马大伟

乳腺癌特异基因(breast cancer specific gene 1,BCSG1)又名SNCG(γ-synuclein gene)，是1997年用cDNA 直接测序法发现的乳腺癌相关基因[1-4]。已有的研究表明BCSG1在正常乳腺组织中低表达, 在乳腺癌组织中高表达，在乳腺癌的预后判断和抗肿瘤药物筛选中有重要作用[ 5-8]。Pan等[9-12]首先报道 BCSG1第一外显子区域CpG岛甲基化状态在基因的表达调控中发挥重要作用，其在正常乳腺组织中呈现高甲基化状态，而在乳腺癌组织中呈现高去甲基化状态，同时其异常去甲基化是其在乳腺癌中异常高表达的重要机制之一。但DNA甲基化可受遗传背景、环境因素等诸多因素的影响，在不同种族人群中，同一基因的甲基化状态及其在基因转录调控中的作用可能存在较大差异[13-16]。关于中国人群乳腺癌患者中BCSG1甲基化与乳腺癌的关系，目前尚无定论。本研究拟通过一定样本量的观察，探讨在中国人群乳腺癌患者中，BCSG1甲基化在乳腺癌发病及良性增生或纤维腺瘤中的作用。探讨位于BCSG1第一外显子区域CpG岛甲基化状态与临床病理特征的关系以及BCSG1甲基化作为乳腺癌分子标志物的可能性。

1 材料与方法

1.1 研究材料

江苏省肿瘤医院2007—2008年经手术切除的具有完整临床病理资料的乳腺组织标本，获取新鲜标本后迅速冻存于液氮，然后转入-70℃冰箱中保存。其中乳腺癌及对应的癌旁组织82例，良性病变组织78例。82例乳腺癌患者，年龄28～75岁，平均年龄56.7岁。其中浸润性导管癌75例，浸润性小叶癌2例，其他5例。

1.2 研究方法

1.2.1 组织标本的基因组DNA 采用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA(德国Qiagen)。具体操作按试剂盒说明书进行。 DNA/RNA微量定量仪测定所提基因组DNA浓度及OD260/OD280。

1.2.2 基因组DNA亚硫酸氢盐修饰 采用DNA Cp G岛甲基化修饰试剂盒(Cp Genome DNA Modification Kit，Chemicon公司，S7820)对DNA样品进行亚硫酸氢钠修饰。具体操作按试剂盒说明书进行。取1.0 μg DNA 样品溶于100 μL H2O 中，加入7.0 μL 3M NaOH，50℃温育10 min。加入550 μL新鲜配制的DNA 修饰试剂Ⅰ，振摇后于50℃避光温育4～16 h。然后进行脱盐、去磺基、二次脱盐，最后用25 μL的TE缓冲液将DNA 洗脱下来。

1.2.3 PCR扩增 设计两对引物，去甲基化特异性引物简称为U(unmethylation)，甲基化特异性引物简称为M(methylation)。见表1。

表1 BCSG1基因甲基化特异PCR引物序列

每个PCR反应体积为25 μL，内含：1.5 mmol/L的MgCl2，200 μmol/L的dNTPs，200 nmol/L的引物，经亚硫酸氢盐修饰的DNA样品1 μL。PCR反应条件：95℃ 15 min，95℃ 40秒，52℃或60℃ 40秒，72℃40秒，共40个循环，最后72℃ 10 min。

1.2.4 PCR产物分析 取8 μL PCR产物于2.0%的琼脂糖凝胶中，100 V电泳约30 min。于凝胶成像系统中进行成像分析。

1.2.5 甲基化状态判定标准 每个样本都用两对引物(U和M)进行MSP扩增，同批修饰处理的基因组CG位点全去甲基化和全甲基化的DNA(Chemicon公司)，分别作为去甲基化和甲基化引物的阳性对照，二者分别只能由去甲基化引物和甲基化引物扩增出相应大小的条带；阴性对照采用加ddH2O而不加模板的PCR体系，见图1。若该基因发生了甲基化，则用甲基化特异性引物可扩增出相应大小的条带，用M表示；若为去甲基化，则用去甲基化特异性引物可扩增出相应大小的条带，用U表示；若该基因发生了部分甲基化，则甲基化和去甲基化特异性引物均可扩增出相应大小的条带。见图2。

图1 MSP检测BCSG1甲基化状态的对照体系；U-DNA：基因组CG位点全去甲基化DNA；M-DNA：基因组CG位点全甲基化DNA；U：去甲基化特异性引物；M：甲基化特异性引物

图2 MSP检测石蜡包埋乳腺组织BCSG1甲基化状态

1.2.6 PCR产物测序 为验证MSP的特异性，随机选取PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.7 统计学处理 应用EpiInfo 6软件，采用两样本率的χ2检验或者Fisher′s确切概率法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中BCSG1甲基化状态检测结果

本组研究中所有组织标本中均检测到去甲基化状态的存在，其中在82例乳腺癌和相应癌旁组织中分别有27例(32.9%)和15例(18.3%)检测到纯合性去甲基化，78例乳腺良性病变组织25例(32.1%)检测到纯合性去甲基化；82例乳腺癌和相应癌旁组织分别有55例(67.1%)和67例(81.7%)检测到甲基化，78例乳腺良性病变组织53例(67.9%)检测到甲基化，均为杂合型甲基化；BCSG1的完全去甲基化状态在乳腺癌旁组织与癌组织(χ2=4.61，P<0.05)、癌旁组织与良性病变组织间(χ2=4.04，P<0.05)差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2～4。

表2 各种乳腺组织中BCSG1的甲基化状态

表3 乳腺癌组织与癌旁组织中BCSG1的甲基化状态

表4 乳腺良性病变组织与癌旁组织中BCSG1的甲基化状态

2.2 BCSG1甲基化状态与乳腺癌临床病理特征的关系

统计结果显示，BCSG1甲基化状态与乳腺癌患者年龄，肿瘤大小，淋巴结转移状况，组织学类型，病理分级之间的差异均无统计学意义。见表5。

表5 BCSG1甲基化状态与临床资料间的关系

3 讨论

BCSG1第一外显子区域的CpG岛的甲基化状态是影响其转录的主要机制之一，而BCSG1甲基化则有可能成为乳腺癌的标志物。然而，DNA甲基化可受遗传背景、环境因素等诸多因素的影响，在不同种族人群中，同一基因的甲基化状态及其在基因转录调控中的作用可能存在较大差异。Gupta等[12-16]的研究就表明，GSTP1，CD44和E-Cadherin等基因的甲基化状态在不同种族人群中存在较大差异。本文研究了乳腺癌患者BCSG1甲基化及其与临床资料的关系并得到如下结果：(1)乳腺癌、癌旁组织以及乳腺良性病变组织中BCSG1第一外显子区域CpG岛的甲基化状态均存在去甲基化；(2)其甲基化状态与临床指标之间无显著关联。已有报道显示[8]，乳腺癌组织中BCSG1的甲基化频率比乳腺癌旁组织和良性病变组织低，而我们的研究结果显示，不仅在癌旁组织，良性病变组织中BCSG1的甲基化频率亦低于乳腺癌旁组织,提示BCSG1的去甲基化在肿瘤发生进程中所起的作用。与国外报道[11-12]不同 ，在中国人群正常组织中，我们也检测到BCSG1的去甲基化状态，这一结果提示我们将甲基化状态用作肿瘤标志物时需考虑遗传背景及种族间的差异。

综上所述，我们的结果显示在中国人群乳腺癌患者中，BCSG1具有独特的甲基化状态和表达模式，这一结果提示BCSG1的甲基化状态及其在乳腺癌发生、发展过程中的作用可能因种族和遗传背景的不同而不同。而BCSG1是否能用作乳腺癌辅助诊断和预后判断的分子标志物还需要在不同种族、不同遗传背景的人群中进行大规模样本的研究。

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