王月丽　周　越　王瑞元　刘桂华　冯科宇

摘要：目的：完善区分肌纤维类型的异染ATPase染色方法，为相关的实验研究提供借鉴和参考。结果发现：染色方案一可显示4种肌纤维类型：I、IIA、IIB和IIC。大鼠骨骼肌在预孵育液pH值4.35左右时，出现最佳染色结果；而蟾蜍骨骼肌在预孵育液pH值4.40～4.70都出现了较佳的染色结果。染色方案二只能区分3种肌纤维类型：I、IIA和IIB。出现较佳结果时，大鼠和蟾蜍预孵育液的pH值也不同。结论：异染腺苷三磷酸酶法区分骨骼肌纤维类型，染色方案一可区分四种肌纤维类型，而染色方案二可区分三种肌纤维类型；出现最佳染色结果时，大鼠和蟾蜍骨骼肌的染色条件稍有不同，存在种属差异。

关键词：肌纤维类型；骨骼肌；异染腺苷三磷酸酶（ATPase）法；甲苯胺蓝

中图分类号：G804.21文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0610-03

肌纤维类型有不同的分型标准，采用组织化学染色方法，根据肌纤维ATP酶染色方法，可以将肌纤维分为I型（慢肌）、II型（快肌），II型纤维又进一步分为A、B、C三种亚型。经典的方法是在1955年由Padykula and Herman［1］首次报道 ，把肌纤维区分为I型和II型，后来又经Guth and Samaha［2］（1969）和Brook and Kaiser［3］(1970)及别的学者改良，可以区分I、IIA和IIB型三种肌纤维，但需要连续切片，并且需要在不同pH值的溶液中分别孵育不同的次数，相邻切片之间对比才能区分出不同的肌纤维类型。1977年Tunell and Hart［4］报道在同一张切片上可以区分出3种肌纤维类型：I、IIA和IIB。1983年Doriguzzi C等［5］ 又有所改进，用阳离子染料甲苯胺蓝和天青A染色，I、IIA和IIB型分别为绿松石色（turquoise），浅紫罗兰色（light violet ），和深紫罗兰色（dark violet），用水性介质封片后，染料很快就会扩散，颜色褪去。用酒精脱水中性树胶封片后，颜色变为深浅不一的蓝色，出现了异染到正染的转移。以上学者的方案都没有很好的区分出IIC型纤维。1990年，Ogilvie and Feeback［6］用人骨骼肌标本首次描述了异染腺苷三磷酸酶法能够在一张切片上同时区分I、IIA、IIB和IIC4种肌纤维类型的方法，并且乙醇脱水中性树胶封片后异染的颜色不褪色，可以长期保持。该方案后来又经Konishi M 等［7］（2000年）改良。因课题需要区分大鼠骨骼肌的肌纤维类型，采用了Ogilvie and Feeback［6］的方法，但并未出现原文所描述的染色结果，又参考Konishi M等［7］的方法，将预孵育液的pH值重新调整后，终于出现了较佳的染色结果。鉴于以前的学者取材对象都是哺乳动物，为了证实种属差异的存在和寻找最佳的染色条件，在参照相关文献［6,7］的基础上，设计了如下实验。

1材料和方法

1.1取材和切片10周龄SD大鼠、蟾蜍（购自北京大学医学部）。大鼠称重后，戊巴比妥钠腹腔麻醉（5 mg/100 g），迅速分离大鼠腓肠肌；破坏蟾蜍的脑组织和脊髓后迅速分离腓肠肌。分别小心剪取约3×3×5 mm的腓肠肌（切勿牵拉），O．C．T.（Lab-Tek Products，Naperville）包埋，投入用液氮预冷的装有异戊烷（-70℃）的小烧杯中骤冷后用锡纸包好放入液氮中保存，用时移入恒冷切片机（-20℃）内。切片厚度10 μm，自然晾干或吹风机冷风吹干备用。

1.2配制溶液1）预孵育液：蒸馏水475 mL，醋酸钾2.45 g，CaCl₂·2H₂O1.30g，用冰醋酸调pH至实验设计要求后加蒸馏水至500 mL。

本研究设定的预孵育液的pH值如下，

大鼠腓肠肌标本：4.25，4.30，4.35，4.40，4.45，4.50，4.60，4.65。

蟾蜍腓肠肌标本：4.35，4.40，4.45，4.50，4.55，4.60，4.65，4.70。

2）Tris缓冲液①：蒸馏水950 mL，Trizma碱（Sigma）12.10 g，CaCl₂·2H₂O2.60 g。

Tris缓冲液②：蒸馏水950 mL，Tris12.10 g，CaCl₂·2H₂O2．60 g。

分别用1N的HCl调pH至7.80后，加蒸馏水至1 000 mL。

3）孵育液①：蒸馏水30 mL，氯化钾185 mg，ATP二钠盐（Sigma）76 mg，氯化钙溶液（0.18M）5 mL，Sigma221(1.5M，2-amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液3.35 mL。用1N或0．5N的HCl调pH至9.40，加蒸馏水至50 mL。

孵育液②：蒸馏水30 mL，ATP二钠盐（Amresco）125 mg，巴比妥钠（0.1M）10 mL，氯化钙溶液（0.18M）5 mL。用1N或0.1 N的NaOH调pH至9.40，加蒸馏水至50 mL。

4）0.1%甲苯胺蓝（Chroma）水溶液。

5）1%的CaCl₂·2H₂O溶液。

所用试剂没有标出的均为国产分析纯试剂。

1.3染色步骤

1.3.1染色方案一（参考Ogilvie and Feeback［6］等的方案，有所改动）1）切片入预孵孵育液，室温2 min。

溶液的pH值是决定染色结果的关键因素，而预孵育液的pH决定了不同类型的肌纤维中ATP酶抑制的程度，也决定了酶活性部位磷酸盐沉淀的浓度，从而最后决定着染色的结果。鉴于前人所确定的染色方案已相对成熟，其中关键因素是预孵育液pH值的不同，所以本研究主要是改变预孵育液的pH值，观察染色结果。

2） Tris缓冲液①换洗3次，每次2 min。目的是去除组织中残留的酸性的预孵媒介，终止反应，使其对孵育液的影响最小。

3） 入孵育液①，室温25 min。

4） 1%CaCl₂·2H₂O水溶液内换洗3次，每次上下提拉切片4次。以除去在ATP-ATPase反应中未结合的磷酸。这影响到其后染色的背景干净与否。

5） 0.1%甲苯胺蓝水溶液内染色90 s或1%甲苯胺蓝水溶液内染色10 s（0.1%的更易控制染液浓度和染色时间）。

6）流动的蒸馏水冲洗切片，最多30 s；或用500 mL烧杯盛蒸馏水，洗去多余染液。

7）快速脱水：95%酒精换1次，上下提拉切片3～5次；再经无水酒精2次，每次上下提拉切片3～5次。此步骤宜快，以保持色调。

8） 二甲苯透明，换两次，每次5 min(因二甲苯为有毒药品，此步骤宜在通风橱中进行，省去此步骤对结果影响不大)。

9） 中性树胶封片。

1.3.2染色方案二采用价廉的Tris缓冲液②和孵育液②，其余试剂和步骤与染色方案一完全相同。

2结果

I-型纤维绿松石（turquoise）色，即蓝绿色，IIA-型纤维淡粉红色(light pink)，IIB-型纤维紫罗兰 (violet) 色，IIC-型纤维深蓝色(dark blue)。

2.1染色方案一大鼠的腓肠肌标本在预孵液pH值为4．35～4.40出现了最佳的染色结果，可以区分四种肌纤维类型：I、IIA、IIB和IIC，其它pH值只能区分三种肌纤维类型：I、IIA、和IIB；蟾蜍腓肠肌标本在预孵液pH值4.40～4.70之间都出现了较好的染色效果，色调稍有差别，但都可区分四种肌纤维类型(图1①-④)。

2.2染色方案二在实验设计的pH值范围内都只能区分出三种肌纤维类型：I、IIA和IIB，没有区分出IIC型纤维。大鼠的腓肠肌标本在预孵液pH值为4.30-4.45之间可以区分三种肌纤维类型，而其它pH值不能很好的区分I型和II型纤维；蟾蜍腓肠肌标本在预孵液pH值4.40-4.70之间都可区分3种肌纤维类型(图1⑤-⑥)。

3讨论

3.1染色原理大多数染料可将组织染成同一颜色的不同深度，例如：酸性品红总是将组织染成不同色调的红色，淡绿将组织染成不同色调的绿色。这些染色反应最后目的物所呈现的颜色和染色剂的颜色相同，称为正色或正染反应。然而某些碱性染料可以将组织染成与染料不同的另一种颜色：如粘液用甲苯胺蓝可染成红色，而其余组织则染成不同色调的蓝色。此种染色反应最后目的物所呈现的颜色和染色剂当初的颜色不同，则称为变色反应，也叫做异染现象。这种组织称为显示异染性，这种染料叫做异染性染料。

采用ATP酶法，用异染性染料甲苯胺蓝显示肌纤维类型的原理是肌原纤维ATP酶在酸性预孵育液的影响下，其不同肌原纤维的ATP酶活性产生了不同程度的抑制，孵育时，ATP酶水解孵育液中的ATP，生成无机磷酸，磷酸被Ca2+捕获沉淀在酶活性部位，磷酸钙与后来的染料结合，并以聚合体的形式存在于酶活性部位。ATP酶活性的不同造成了局部磷酸钙沉淀和染料聚合体浓度的不同，从而呈现不同的颜色。因此影响肌纤维着色不同的最重要因素就是最初沉淀在每根肌纤维内磷酸钙含量的不同。在Ca2+存在的情况下，磷酸钙是由肌纤维的ATP酶水解孵育液中的ATP产生无机磷酸与Ca2+结合生成的，也就是肌纤维ATP酶的活性决定了酶活性部位磷酸钙沉淀的浓度，从而决定了最后的染色结果。I型纤维ATP酶活性抑制程度较轻，活性较强，获得的磷酸钙浓度最高，其次是IIB和IIC型，IIA型浓度最低。乙醇脱水中性树胶封片后I型纤维绿松石（turquoise）色，即蓝绿色，有深色的边缘，染色不均，光镜下容易区分；IIA-型纤维浅蓝色（light blue）或粉红色(pink)；IIB型纤维紫罗兰 (violet) 色； IIC型纤维深蓝色(dark blue)。II型纤维中，IIA颜色最浅，IIC型颜色最深，但其染色均匀，没有深色边缘，与I型纤维容易鉴别［6］。

异染性着色分为酒精稳定型和酒精不稳定型，依据是经过常规的酒精脱水过程后其色调是否保持不变。本研究中，骨骼肌纤维的异染性着色为酒精不稳定型，酒精有脱水和脱色的作用。染料与沉淀在ATP酶活性部位的磷酸钙结合得并不牢固，酒精脱水时，部分染料也会被脱去，而且与酒精脱水时间正相关，如果时间够长，颜色会完全褪去。因此脱水过程要快，要产生稳定的颜色并区分出不同类型肌纤维，严格控制这一步很重要。丙酮也可作为脱水剂，其去除较少的染料，平衡后，选择乙醇为脱水剂是因为丙酮不够环保。

肌原纤维ATP酶的活性和溶液的pH值决定着染色结果。但溶液中溶质的浓度也会对染色结果产生影响，特别是孵育液中的ATP二钠盐作为反应的底物，其浓度会随染色过程的进行而减小，即使现用现配，同一批切片之间的的染色结果在色调上也会有所差异。但只要能够将不同类型的肌纤维区分出来，实验就是成功的。

3.2种属差异以前的研究都集中在哺乳动物，本研究首次将哺乳动物大鼠和两栖动物蟾蜍同时做对比研究。染色方案一可以区分四种主要的肌纤维类型：I、IIA、IIB和IIC，方案二可区分I、IIA和IIB3种肌纤维类型。两个染色方案中，大鼠腓肠肌均在预孵育液pH值为4.35左右时出现最佳染色结果，与Ogilvie and Feeback［6］最后采用的方案的预孵育液pH为4.5～4.6（人骨骼肌标本）并不一致，而与Konishi M等［7］改良的方案的预孵育液pH值为4.35（鼠骨骼肌标本）一致。与大鼠相比，蟾蜍腓肠肌在预孵育液pH值较宽的范围4.40～4.70都可以出现较好的染色结果。

从前人和本研究的结果可以看出，种属差异的确存在，这要求在以后的研究中要注意这个问题。这种种属差异主要是源于不同动物骨骼肌纤维ATP酶对酸性预孵育液的反应和其生理特性的不同。

同样是成年的大鼠和蟾蜍，其肌纤维直径相差较大，参照附图中的标尺可以看出，蟾蜍肌纤维直径是大鼠的2.5倍左右，大鼠肌纤维直径40 μm左右，而蟾蜍肌纤维直径100 μm左右。并且蟾蜍骨骼肌组织切片在晾干后，细胞出现很多“裂缝”，染色后依然存在，且快肌纤维较多。是否是因为两栖动物蟾蜍肌组织含水量较高而形成的，有待进一步研究。

3.3注意要点

3.3.1组织速冻及冷冻切片及时妥当速冻肌肉活检组织，防止酶的失活及冰晶形成；选择恰当的切片温度，一般恒冷室温度控制在-20℃左右，温度太高，切片容易皱折，温度过低，切片容易产生破洞；切片后及时染色，以避免酶的扩散或失活，影响结果。

3.3.1溶液的pH值溶液的pH值是实验成功的关键因素，预孵育液和孵育液的pH值务必要准确。要求:器皿洁净；试剂称量准确；预孵育液、 孵育液应现用现配；必备一台精密酸度计，使用前要校准，调节过程要认真，保证溶液pH值的准确性。

3.3.2脱水和封片脱水过程应严格控制，以保持色调稳定；不可用水性介质（如明胶等）封片，因其可使染料从肌纤维上洗提出来。

4结论

采用ATP酶法，用异染性染料甲苯胺蓝，染色方案一可以在一张切片上同时显示四种肌纤维类型：I、IIA、IIB和IIC；染色方案二可以区分三种：I、IIA和IIB，色调与方案一基本一致。如果实验不需要区分IIC型纤维或实验经费有限，可采用方案二，其所用试剂价廉，染色结果也相对理想。

两种方案中，大鼠腓肠肌均在预孵育液pH值为4.35左右时出现最佳染色结果，蟾蜍腓肠肌在预孵育液pH值较宽的范围4.40~4.70都可以出现较好的染色结果。大鼠和蟾蜍的染色条件稍有差别，存在种属差异。

不同类型的骨骼肌纤维具有不同的形态、机能和代谢特征，这在运动实践中具有十分重要的意义。优秀运动员骨骼肌纤维类型的分布特征表明运动能力与肌纤维类型密切相关。由于人体骨骼肌纤维类型很大程度上取决于遗传，因此，肌纤维类型被认为是运动员科学选材的一项重要指标。另外在一些神经肌肉疾病的诊断和组织学研究中都需要区分肌纤维类型，以进行对比分析。希望本文能为相关实践和研究提供借鉴和参考。

参考文献：

［1］ Padykula HA,Herman E. Factors affecting the activity of adenosine triphosphatase and other phosphatases as measured by histochemical techniques［J］.Histochem Cytochem,1955a,3:161-169.

［2］ Guth L,Samaha F. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle［J］. Exp.Neurol,1969,25:138-152.

［3］ Brooke MH,Kaiser KK. Muscle fiber types:how many and what kind?［J］.Arch Neurol,1970,23:369-379.

［4］ Tunell GL,Hart MN. Simultaneous determination of skeletal muscle fiber types I,IIA,and IIB by histochemistry［J］. Arch.Neurol,1977,34:171-173.

［5］ Doriguzzi C,Monhini T,Palmucci L,et al. A new method for myofibrillar Ca2+-ATPase reaction based on the use of metachromatic dyes:its advantages in muscle fibre typing［J］.Histochemistry,1983,79:289-294.

［6］ Ogilvie RW,Feeback DL. A metachromatic dye-ATPase method for the simultaneous identification of skeletal muscle fiber types I,IIA,IIB and IIC［J］.Stain Technology, 1990,65(5):231-241.

［7］ Konishi M,Iwamoto S,Ohara H,et al. Two-Dimensional Changes of Muscle Fiber Types in Growing Rat Hind Limb［J］. Acta Anat.Nippon,2000,75:267-273.