煤炭微生物絮凝剂的研究

2008-04-26张东晨吴学凤刘志勇孙培林

安徽理工大学学报·自然科学版 2008年3期

关键词：煤炭

张东晨　吴学凤　刘志勇　孙培林

摘要：微生物絮凝剂属于新型天然高分子絮凝剂，它与传统化工类絮凝剂相比具有絮凝效果显著及环保等优点。本文把酱油曲霉作为煤炭微生物絮凝剂的产生菌，采用离心沉降和超声波破碎等方法，研究了酱油曲霉的培养液原液、培养原液离心上清液、破碎液、破碎液离心上清液等含有不同成分的四种菌体提取液对煤泥水的絮凝效果。絮凝试验结果表明：酱油曲霉具有不同成分的菌体产生液对煤泥水都具有一定的絮凝作用。其中采用破碎液离心上清液，当菌液量为1.5％，在添加助凝剂（CaCl2）用量为0.2 g/L的条件下。絮凝率最高可达到90.76％。作为煤炭生物絮凝剂酱油曲霉具有优良的絮凝效果。

关键词：煤炭；微生物絮凝剂；酱油曲霉

中图分类号：TD925.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1098(2008)03-0042-04

微生物絮凝剂是利用生物技术，通过对具有絮凝作用的微生物进行培养、抽提、精制而得到的一种具有可生物降解性和安全性的新型、高效、无毒的天然高分子絮凝剂。其独特的生物可降解性质缘于微生物絮凝剂特有的机能性蛋白质及机能性多糖类物质，这是化工类无机凝聚剂或合成有机高分子絮凝剂所不具备的［1-5］。本文选择酱油曲霉作为煤炭微生物絮凝剂的产生菌，并利用含有不同成分的四种酱油曲霉菌体提取液进行了煤泥水絮凝试验。

1 试验研究方法

1.1 主要试剂和仪器

药品试剂：蔗糖（生化）、琼脂（生化）、硝酸钠（NaNO₃）、磷酸氢二钾（K₂HPO₄ ）、七水硫酸镁（MgSO₄•7H₂O）、氯化钾（KCl）、七水硫酸亚铁（FeSO₄•7H₂O ）等。

仪器：恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、手提式压力蒸汽灭菌器、磁力加热搅拌器、超声波破碎仪、回旋式振荡器、低速离心机、752型紫外分光光度计、数码电子显微镜等。

1.2 菌种的来源、活化与富集培养

试验菌种购自中国科学院微生物研究所(As3.495（Asp.sojae）)。

采用查氏培养基作为菌种活化富集培养基。由于菌种保藏在真空安瓿管内，使用前需要进行菌种的恢复培养，其步骤如下：

(1) 安瓿管开封用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。

(2) 菌株恢复培养用无菌吸管吸取0.3～0.5 mL适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，移植于斜面培养基上（或平板培养基，试验中制备了平板、斜面和液体培养液三种培养基），于电热恒温培养箱中28 ℃培养。活化48 h后培养基中出现少许黄色菌落，随培养时间延长菌落逐渐长大，最后连成线，并且某些菌落变成暗黄色。对平板菌落进行镜检。菌种活化后置冰箱中4 ℃保存备用［6-12］。

无菌条件下用接种环自查氏平板上挑取经活化的单个纯菌落，植入装有查氏培养液的试管中28 ℃培养72 h，观察发现：培养液中有悬浮絮状菌丝，即实现了酱油曲霉的增殖，然后进行镜检(见图1～图3)。

1.3 制备微生物絮凝剂

在250 mL的锥形瓶中装入50 mL查氏培养液，灭菌后将5 mL酱油曲霉富集培养液用无菌移液管接种于锥形瓶中，在28 ℃，140 r/min的恒温振荡器上培养，分别于接种后36 h、 48 h、 6 0 h、72 h、84 h、96 h每隔12 h取培养液制成生物絮凝剂，并测定其对煤泥水的絮凝率。四种微生物絮凝剂分别为：培养液原液（A）、培养液离心上清液（B）、破碎液（C）、破碎液离心上清液（D ）。

取部分培养液超声波破碎30 min，得到破碎液；再分别取部分培养液和破碎液分别以3 000 r/min转速离心30 min ，得到两种离心上清液(见图4) 。这样得到四种微生物絮凝剂：培养原液（A）、培养液离心上清液（B）、破碎液（C）、破碎液离心上清液（D）。

1.4 酱油曲霉菌体产生液的絮凝试验研究

取制备的絮凝剂（A）即菌体培养原液对酱油曲霉的生长量进行测定，并用pH计测定不同培养时间点时培养液的pH。

絮凝试验所用煤泥水取自淮南望峰岗选煤厂的浮选尾煤水，试验时将90 mL的煤泥水置于烧杯中，加入一定量微生物絮凝剂，加煤泥水至100 mL，用磁力搅拌器慢速搅拌2 min后，将煤泥水倒入100 mL量筒中，观察煤泥水絮凝沉降情况，静置30 min后吸取一定量上清液，用分光光度计在550 nm下测其吸光度［13-14］。

微生物絮凝剂的絮凝效果以絮凝率来衡量，其计算公式为

絮凝率=(Ao-Ai)/Ao×100%

式中：Ao为对照组上清液的OD550值；Ai为加入微生物絮凝剂絮凝之后上清液的OD550值，OD值的测定在752型紫外分光光度计550 nm处测定。

煤泥水絮凝试验中，四种菌液的用量分别为：0.5%、1%、1.5%、2%。添加助凝剂（CaCl₂）用量为：0.2 g/L。其作用是降低煤粒表面电荷对生物絮凝剂。

2 试验结果与分析

2.1 酱油曲霉生长量及细菌培养原液pH分析

取絮凝剂（A）即细菌培养原液，根据微生物生长量的测定方法，对酱油曲霉在不同生长时期进行生长量的测定，得到酱油曲霉的生长曲线（见图5）。用pH计测定不同培养时间点时细菌培养原液的pH。得到细菌培养原液pH随培养时间的变化曲线（见图6）。

培养过程中24 h之前酱油曲霉的菌量几乎没有增加，24～36 h酱油曲霉生长非常缓慢，生长量很小，36 h之后菌体开始迅速生长，此时生长速度最快，60～84 h菌体生长速度较之前12 h慢，84 h之后菌体又一次开始快速生长，由此可知，酱油曲霉的生长期应处于36～96 h。

随着培养时间的延长，培养液的pH呈现出不稳定的变化，但总体趋势是随着培养时间的延长pH逐渐降低。在酱油曲霉的生长过程中培养液的pH逐渐降低，其原因可能是由于在酱油曲霉生长过程中会代谢出一种酸性物质，而且随着培养时间的延长，菌体量增加导致培养液的pH继续降低。

2.2 絮凝试验结果分析

微生物培养48 h时的絮凝率较高，而随着培养时间延长，在60 h、 72 h时絮凝率都有降低，培养84 h时絮凝率又有增高，然后絮凝率又随培养时间延长而降低(见图7a～图7b)。而图7c～图7d中第一个絮凝率最高点也是48 h，但是第二个最高点却是在72 h时，微生物絮凝剂（D），即破碎液离心上清液，在菌体培养48 h，加药量为1.5％时的絮凝率达到89.56％。培养72 h时，添加菌液量为1.5％，絮凝率最高可达到90.76％。

培养48 h时，菌体代谢产生的絮凝物质还是很少量的，此时主要起絮凝作用的是菌体本身，随着培养时间的延长，菌体代谢产生的具有絮凝作用的物质越来越多，慢慢起絮凝作用的主要物质转变为菌体的代谢产物和菌体内物质。但是，这些不同类型的微生物絮凝剂相互之间对絮凝作用会形成干扰，降低絮凝效果。所以表现为：随着培养时间的延长，菌体代谢产物越来越多，而絮凝剂的絮凝率却在逐渐降低，达到最低点。说明菌体代谢产物和菌体内物质可在一定程度上抑制菌体本身的絮凝作用。此后，代谢产物的絮凝作用超过了菌体本身，起主要絮凝作用，絮凝率又逐渐增加。根据菌体生长的规律，菌体都有一个存活期，达到一定时间菌体就会死亡，从而生命活动终止，不能产生代谢产物，所以培养时间继续延长，絮凝剂的絮凝效果再一次降低。

破碎液的絮凝率比培养原液高。这是因为超声波破碎后，破坏了菌体的表面结构，使得菌体内部物质裸露出来，以上的絮凝效果说明微生物絮凝剂不仅仅存在于菌体的表面，也存在于菌体的代谢产物及菌体体内。

图7 不同培养时间条件下四种菌液对煤泥水的絮凝效果对比试验表明，由于酱油曲霉破碎液中含有的菌体及菌体破碎体等物质对絮凝有一定的干扰作用，而破碎离心上清液去除了对絮凝干扰的物质。因此，破碎离心上清液（D）的絮凝效果要优于单纯破碎液（C）的絮凝效果（见图8）。酱油曲霉的破碎液离心上清液，当菌体培养72 h，添加菌液量为1.5％，助凝剂（CaCl₂）用量为0.2 g/L时，煤泥水絮凝率达到了90.76％。

3 结论

(1) 生物絮凝剂属于天然高分子絮凝剂，它与化工类无机凝聚剂和有机高分子絮凝剂相比更加绿色环保。在煤炭加工领域，对生物絮凝剂的研究具有重要的现实意义。

(2) 本文选择酱油曲霉作为煤炭微生物絮凝剂的产生菌，采用离心沉降和超声波破碎等抽提制取方法，研究了含有不同絮凝活性成分的四种菌体提取液对煤泥水的絮凝效果。絮凝试验结果表明：酱油曲霉作为生物絮凝剂产生菌，其具有不同成分的菌体产生液对煤泥水都具有一定的絮凝作用。研究表明，酱油曲霉作为煤炭生物絮凝剂产生菌具有性能优良的絮凝效果，应对其进行更深入研究。

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